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02.RNA分離
在細胞裂解后，加入氯仿進行離心。氯仿的密度大于水，且能與苯酚結合，從而抽提酸性的苯酚。苯酚的存在促使RNA進入水相，而大部分DNA和蛋白質則保留在中間相或下層有機相中。通過離心，可以實現RNA與其他細胞成分的分離。

①異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一種強力的蛋白質變性劑，能迅速溶解蛋白質，使蛋白質二級結構消失，細胞結構降解，從而使核蛋白與核酸解聚，將RNA釋放到溶液中。同時，它還能有效抑制細胞釋放出的核酸酶活性，保護RNA的完整性。
②苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖然可以變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此常與其他成分聯合使用以增強效果。
③8-羥基喹啉可以抑制RNase活性，與氯仿聯合使用時可顯著增強對內源性和外源性RNase的抑制作用。
④β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵，從而進一步抑制RNase活性。

1. 12孔板每孔加入700 μL的Trizol試劑（6孔板每孔加入1 mL，組織切取50 mg左右，加入1 mL的Trizol）后，于室溫裂解10 min，使核酸蛋白復合物完全分離。

2. 用槍吹打細胞并將其轉移至新的EP管中，每管加入140 μL的三氯甲烷（即加入Trizol體積1/5的三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min）。

3. 12000 rpm，4 ℃，離心20 min，樣品會分成3層：紅色的有機相、中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中。

4. 小心轉移上層水相（300 μL）至新的EP管中，這個過程操作要格外小心，不要吸取到有機相，可以使用黃槍頭套著小槍頭進行吸取，分2次吸取。加入等量體積300 μL的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min，使RNA沉淀。

5. 12000 rpm，4 ℃，離心15 min，棄上清。

6. 加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4 ℃，離心5 min，重復2次洗滌能夠提高RNA的純度。

7. 離心結束后，使用吸引器將乙醇吸取干凈；無吸引器的話可以將上清倒掉后，再離心1～2 min，使用黃槍頭套白槍頭的方法將上清棄去。

8. 室溫放置晾干RNA沉淀，一般2～5 min即可，具體時間看RNA沉淀的大小，切勿干燥過度，會降低RNA的溶解度。

9. 加入適量DEPC水（無RNase水）用槍頭吸打幾次使RNA充分溶解。

[小編提醒] rpm在論文寫作時應換算為“×g”的形式。