組織樣本EdU檢測難點突破：固定液選擇與通透處理全方案優(yōu)化
2025-06-27 16:30:37
來源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
固定液選擇與通透處理全方案優(yōu)化由普拉特澤生物給大家解答與分享，普拉特澤生物細胞檢測平臺可承接各種細胞檢測外包服務(wù)，包括檢測細胞凋亡、細胞增殖、細胞侵襲等實驗外包服務(wù)，本文是我們在承接數(shù)百例EdU檢測中，對操作過程中的常見問題與大家留言咨詢最多的問題進行回答與建議，快來收藏吧！
組織樣本的特殊性常導(dǎo)致信號弱、背景高、形態(tài)破壞三大痛點。普拉特澤生物針對固定液選擇與通透處理兩大核心難點，提供經(jīng)實戰(zhàn)驗證的解決方案
——組織EdU檢測的三大核心挑戰(zhàn)
固定與通透的平衡困境
→過度固定：醛類固定劑過度交聯(lián)導(dǎo)致抗原遮蔽，阻礙EdU點擊反應(yīng)
→通透不足：組織致密結(jié)構(gòu)阻礙試劑滲透，深部細胞標(biāo)記失敗
→核酸移位風(fēng)險：酸性/醇類固定液引起DNA遷移，定位失真
組織自發(fā)熒光干擾
尤其常見于：
富含彈性蛋白的組織（血管、肺）
含脂褐素的衰老組織（腦、肝）
多重標(biāo)記兼容性差
需同時滿足：
EdU點擊化學(xué)效率
目標(biāo)抗原表位保存
細胞結(jié)構(gòu)完整性
——固定液選擇：科學(xué)匹配組織類型
█ 醛類固定劑：首選4% PFA的精準(zhǔn)控制
適用組織：大多數(shù)軟組織（腦、肝、腎、腫瘤）
優(yōu)化方案：
- 濃度：4% PFA（pH 7.4）
- 時間：室溫2-4小時（或4℃過夜）
- 關(guān)鍵：灌注固定 > 浸泡固定（尤其對腦組織）
禁忌：
避免使用含乙酸的固定液（如Bouin's液）—— 引起DNA片段化
█ 醇類固定劑：特殊場景的替代方案
適用場景：
需要保留磷酸化表位（如p-Histone H3）
脂肪組織（減少脂質(zhì)流失）
推薦配方：
- 冰乙醇:冰醋酸 = 3:1（v/v）
- 4℃固定1-2小時
缺陷：可能導(dǎo)致組織收縮
█ 復(fù)合固定劑：平衡形態(tài)與抗原保存
推薦配方：
- 4% PFA + 0.5% 戊二醛（增強硬度）
- 適用：骨組織、軟骨
- 警告：戊二醛>1%將淬滅熒光！
——通透處理：突破組織屏障的關(guān)鍵
目標(biāo)：打開生物膜屏障，允許>500Da分子通過
█ 通透劑選擇矩陣
進階通透策略
梯度通透法（針對厚組織切片）
減少邊緣過度通透導(dǎo)致的組織脫落
酶輔助通透
推薦：
膠原蛋白酶IV（1mg/ml，37℃×15min）→ 纖維化組織
透明質(zhì)酸酶（2U/μl，37℃×30min）→ 富含胞外基質(zhì)組織
——實戰(zhàn)工作流：組織EdU檢測七步法
▲活體標(biāo)記：EdU腹腔注射（5mg/kg）
▲灌注固定：4% PFA心內(nèi)灌注（優(yōu)于浸泡固定3倍?。?/span>
組織處理：
▲脫水：30%蔗糖溶液沉底（防冰晶）
▲包埋：OCT > 石蠟（避免高溫抗原破壞）
▲切片通透：0.5% Triton + 0.1% 皂苷混合液×45min
Click反應(yīng)：
- 試劑：Click-iT? Plus EdU Kit（貨號：C10637）
- 染料：AF647（避免自發(fā)熒光干擾）
- 時間：避光30min（延長至60min穿透>50μm切片）
抗體染色：抗目標(biāo)抗原抗體（如Ki-67、GFAP）
自發(fā)熒光阻斷：
0.1% 剛果紅（淬滅脂褐素）
0.3M 甘氨酸（減少醛基熒光）
——組織特異性優(yōu)化方案
——故障排除：拯救失敗實驗
——三維組織EdU成像
透明化技術(shù)聯(lián)用
流程：
優(yōu)勢：實現(xiàn)全器官增殖細胞定位
多重免疫-EdU標(biāo)記
案例：
EdU-AF647（增殖細胞）
CD31-AF555（血管）
α-SMA-AF488（成纖維細胞）
關(guān)鍵：采用酪酰胺信號放大（TSA）提升弱抗原信號
——最后的最后
組織EdU檢測的成功取決于：
精準(zhǔn)匹配的固定方案 + 階梯式通透策略 + 組織特異性優(yōu)化。
遵循“溫和固定、梯度通透、紅外染料避讓自發(fā)熒光”三大原則，可突破90%以上的技術(shù)瓶頸。
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