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     大家好！今天普拉特澤生物繼續(xù)跟大家一起整理了這些疑問(wèn)部分，希望和大家交流學(xué)習(xí)~

WB實(shí)驗(yàn)(Western Blot，蛋白質(zhì)印跡)是一種用于檢測(cè)特定蛋白質(zhì)在復(fù)雜樣品中存在及其相對(duì)表達(dá)量的分子生物學(xué)技術(shù)其主要步驟為:樣品制備→電泳→轉(zhuǎn)膜→封閉→抗體孵育→>檢測(cè)(顯影和成像)

——常見(jiàn)疑問(wèn)合集

一.Marker
1.什么是Marker ?

Marker是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，一些已知分子量的蛋白質(zhì)的混合物，用于指示蛋白質(zhì)條帶的大小?？梢灶?lèi)似為一把“尺子”，驗(yàn)證目的蛋白的分子量。

2.Marker的作用是什么?

①指示待測(cè)蛋白分子量

②顯示蛋白在凝膠上的電泳進(jìn)度
③可協(xié)助標(biāo)記加樣順序4)判斷轉(zhuǎn)膜效率

④判斷轉(zhuǎn)膜效率

3.Marker的分類(lèi)

①未預(yù)染Marker:

優(yōu)點(diǎn):非預(yù)染蛋白沒(méi)有附帶染料分子或標(biāo)記分子，指示大小正好是蛋白原本的大小，所以最準(zhǔn)確。

缺點(diǎn):非預(yù)染蛋白Marker在電泳過(guò)程中看不到，電泳結(jié)束后經(jīng)過(guò)蛋白染色后才能起指示作用，無(wú)法在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中起預(yù)示作用。

②預(yù)染Marker:(wb常用)

優(yōu)點(diǎn):肉眼看見(jiàn)，可直接觀(guān)察電泳進(jìn)程和轉(zhuǎn)膜是否完全，較為常用。

缺點(diǎn):Marker蛋白跟染料共價(jià)偶聯(lián)導(dǎo)致蛋白分子電泳的遷移效率發(fā)生改變，其指示的分子量不是精確值而有一定誤差。

3 曝光Marker.

在曝光步驟中，可將目的條帶和Marker條帶同時(shí)曝光顯示，減小誤差，并克服了但克服了預(yù)染 Marker 遷移率的改變，但價(jià)格昂貴

4.預(yù)染Marker的選擇:

①分子量范圍

蛋白marker分為低分子量，寬分子量，高分子量幾類(lèi)。根據(jù)需求選擇

②質(zhì)量和穩(wěn)定性

③與膜的親和性

二.轉(zhuǎn)膜

1.轉(zhuǎn)膜的原理

將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到與其具有高度親和力的膜上(一般常用pvdf膜)，使蛋白后續(xù)更容易與抗體結(jié)合，便于后續(xù)抗體檢測(cè)。

原理:利用電場(chǎng)使帶負(fù)電的蛋白質(zhì)從凝膠向正極移動(dòng)，最終附著在膜上。

2.轉(zhuǎn)膜過(guò)程中甲醇的作用

轉(zhuǎn)膜液中甲醇的作用∶

① 增強(qiáng)蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合

甲醇能去除蛋白質(zhì)表面的SDS，使蛋白質(zhì)更容易與膜(如PVDF或硝酸纖維素膜)結(jié)合，提高轉(zhuǎn)膜效率。

② 防止凝膠膨脹

結(jié)合，提高轉(zhuǎn)膜效率。

② 防止凝膠膨脹

甲醇能防止凝膠過(guò)度吸水膨脹，保持凝膠結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，確保蛋白質(zhì)有效轉(zhuǎn)移。

③甲醇能改善蛋白質(zhì)從凝膠向膜的轉(zhuǎn)移,特別是對(duì)高分子量蛋白質(zhì)效果顯著。

甲醇激活PVDF膜的作用:

①用甲醇激活PVDF膜，可以將膜從疏水性變?yōu)橛H水性,提高膜對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力。

②甲醇可以減小膜的孔徑，讓PVDF膜的孔徑變小，防止小分子量蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中丟失。

三.封閉

1.孵育一抗體前為什么需要用脫脂牛奶封

閉?

膜具有高蛋白結(jié)合能力，可以結(jié)合任何可用的蛋白，包括用于檢測(cè)的抗體。如果不進(jìn)行封閉處理，抗體可能會(huì)非特異性地結(jié)合到膜上未被樣品蛋白占據(jù)的位置，導(dǎo)致高背景信號(hào)

合到膜上未被樣品蛋白占據(jù)的位置，導(dǎo)致高背景信號(hào)。

封閉的作用

①減少非特異性背景:封閉劑通過(guò)占據(jù)空白位點(diǎn)，阻止抗體非特異性結(jié)合，從而降低背景噪音，使條帶更清晰。

②增強(qiáng)特異性信號(hào):有效的封閉可以幫助抗體更專(zhuān)一地結(jié)合到其目標(biāo)蛋白，提高檢測(cè)的特異性。

(脫脂牛奶是最常用的封閉劑，成本低廉且富多種蛋白。但不宜用于磷酸化蛋白檢測(cè)，磷酸1蛋自盡量使用BSA)

四.孵育抗體

1.一抗二抗的原理，為什么需要使用二抗?

原理

一抗的作用是特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白的某個(gè)抗原表位，這個(gè)過(guò)程是由一抗的可變區(qū)(Fab區(qū))完成的。二抗識(shí)別并結(jié)合一抗的恒定區(qū)(Fc區(qū))，而不是目標(biāo)蛋白本身

2..為什么需要使用二抗？

①二抗可以通用

同一種動(dòng)物來(lái)源的抗體恒定區(qū)是相同的,因此只需要制造一種通用的二抗(如抗免二抗)就可以用于所有由免子產(chǎn)生的一抗，無(wú)論這些一抗識(shí)別的是哪種蛋白。②放大信號(hào)

一個(gè)一抗可以結(jié)合多個(gè)二抗，多個(gè)二抗的結(jié)合帶來(lái)了更多的信號(hào)分子，從而增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的信號(hào)。

3..稀釋一抗二抗一般使用什么液體?                      

因此只需要制造一種通用的二抗（如抗兔二抗），可以用于所有由兔子產(chǎn)生的一抗

3.一抗二抗一般使用什么液體 ?

二抗稀釋配方：PBST/TBST+5% BSA（血清白蛋白），比例 1:5000~60000           

(Tween-20可以幫助稀釋的二抗均勻分散，并提高其與目標(biāo)蛋白的結(jié)合。

BSA可以作為阻斷劑，降低非特異性結(jié)合，提高實(shí)驗(yàn)的特異性）

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