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基于CRISPR/Cas9的原理，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染cas9/gRNA表達(dá)載體后，cas9-gRNA表達(dá)并切割，此時(shí)細(xì)胞分為四種：轉(zhuǎn)染陰性、轉(zhuǎn)染陽(yáng)性（未被編輯、被編輯但未成功敲除、成功敲除）；通過抗性可篩選出轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞，但不能篩選出成功敲除的細(xì)胞，所以需要通過篩選單克隆得到成功敲除的細(xì)胞～

1.在轉(zhuǎn)病毒的前一天將目的細(xì)胞鋪到 12孔板，以第二天密度達(dá) 30-50%為宜(鋪板的時(shí)候種梯度密度，第二天選取密度合適的孔)3.轉(zhuǎn)病毒:棄舊培養(yǎng)基，更換新的完全培養(yǎng)基，將病毒液解凍后加入孔板，輕輕搖勻使病毒液均勻分布

2.病毒感染 24h 后撤掉病毒液，換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1天5.將孔板內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)入 T25 培養(yǎng)瓶,并加入對(duì)應(yīng)抗性的藥物(嘌呤、G418、潮霉素等)篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞

3.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況篩選 3-7天，鋪板提蛋白驗(yàn)證混合克隆的敲低效率，同時(shí)收細(xì)胞 DNA 進(jìn)行sanger 測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果和混合克隆敲低效率，選擇兩個(gè)片段(一般會(huì)有三個(gè)SgRNA)篩選單克隆細(xì)胞7.單克隆篩選:a.流式分選:提前在96孔板加好100mL/孔培養(yǎng)基，將細(xì)胞消化后上機(jī)分選即可，一個(gè)液滴只有一個(gè)細(xì)胞

b.極限稀釋法:將細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，取200個(gè)細(xì)胞制備細(xì)胞懸液(100mL培養(yǎng)基中含有一個(gè)細(xì)胞)，取100L/孔接種于96孔板8.挑選單克隆細(xì)胞:96 孔板培養(yǎng)1-2周后顯微鏡下挑選出單個(gè)細(xì)胞克隆的孔，做好標(biāo)記并補(bǔ)加100mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1周左右(培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況而定)

4.篩選與鑒定:將96孔板內(nèi)單克隆細(xì)胞消化至12孔板，長(zhǎng)滿后將細(xì)胞消化，取1/3至6孔板保種，2/3接種至另一個(gè)6孔板用于提蛋白鑒定目的基因是否成功敲除

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