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   ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟由普拉特澤生物旗下科研培訓(xùn)品牌——春風(fēng)學(xué)院給大家總結(jié)分享，普拉特澤生物自建3000㎡生物實(shí)驗(yàn)室，專業(yè)承接各類生物實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，ELISA作為表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，承接了上千例的實(shí)驗(yàn)代做，積累了豐富的實(shí)操經(jīng)驗(yàn)，文章末更為大家附上ELISA實(shí)驗(yàn)的視頻教程，一起來學(xué)習(xí)吧！

   上篇給大家講到，ELISA分為多種不同的檢測(cè)方法，今天我們就從直接法ELISA、間接法ELISA、夾心法ELISA、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA四種方法給大家詳細(xì)講解。

   一、直接法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

   將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上，然后加入稀釋好的特異性的酶標(biāo)抗體，孵育后加入底物顯色并判讀結(jié)果。

直接ELISA操作很簡(jiǎn)單，步驟也比較簡(jiǎn)練，但是其應(yīng)用范圍還是非常有限的，一個(gè)重要的原因是這種ELISA中只經(jīng)過了一步信號(hào)放大（酶的放大），所以其靈敏度不是很高；另外，其測(cè)定的對(duì)象也非常有限，只能測(cè)定酶標(biāo)記的分子。

   二、間接法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟（具體操作可以參考說明書哦）

   1、包被抗原：用包被緩沖液稀釋抗原至最適濃度（5～20 ug/ml）各0.3 ml加于微反應(yīng)板每個(gè)凹孔中,4℃過夜或37℃水浴2～3小時(shí)，貯存冰箱。

   2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

   3、加被檢標(biāo)本：每凹孔加入用含有0.05%吐溫-20的稀釋緩沖液稀釋的被檢血清各0. 2 mL，37℃，作用1～2小時(shí)。

   4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

   5、加入酶結(jié)合物：每凹孔加入稀釋緩沖液稀釋的酶結(jié)合物0.2 mL37℃作用1～2小時(shí)。

   6、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

   7、加入0.2 mL底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 mL底物加0.1 mL終止劑）。

   8、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。

   9、觀察記錄結(jié)果：目測(cè)或用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定（OPD用492 nm）OD值。

   三、夾心法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

   1、將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗體。

   2、 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)。

   3、洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗體，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)。

   4、洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體，與一次抗體鍵結(jié)。

   5、洗去多余未鍵結(jié)二次抗體，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果。

   四、競(jìng)爭(zhēng)法ELISA詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟

   1、包被抗體：用包被緩沖液稀釋特異性抗體球蛋白至最適濃度（1～10 ug /ml），每凹孔加0.3 ml，4℃過夜，或37℃水浴3小時(shí)，貯存冰箱。

   2、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

   3、分2組，a組加酶標(biāo)記抗原和被檢抗原混合液0.2 ml，b組只加酶標(biāo)記抗原液0.2 ml，37℃作用1～2小時(shí)。（混合液可作成不同稀釋度）

   4、洗滌：移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液（含0.05%吐溫-20）洗3次，每次5分鐘。

   5、加入0.2 ml底物溶液于每個(gè)凹孔（OPD或OT），室溫作用30分鐘（另作一空白對(duì)照，0.4 ml底物加0.1  mL終止劑）。

   6、加終止劑：每凹孔加2 M H2SO4或2 M檸檬酸0.05 mL。

   7、用酶標(biāo)比色計(jì)測(cè)定a、b兩組OD值，并求出a、b、OD值的差數(shù)。

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