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        大家好，今天普拉特澤生物繼續(xù)給大家介紹一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)——支原體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。支原體是一類(lèi)缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，極易感染實(shí)驗(yàn)室中的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，相信每一個(gè)親手養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)員都對(duì)這種又小又無(wú)處不在的原核生物深?lèi)和唇^，一個(gè)不小心，培養(yǎng)基細(xì)胞團(tuán)滅還摸不出原因。普拉特澤表達(dá)檢測(cè)平臺(tái)為廣大科研服務(wù)人員提供專(zhuān)業(yè)的支原體檢測(cè)外包服務(wù)，歡迎咨詢(xún)。

        那現(xiàn)在我們先來(lái)看看，什么是支原體吧~

        支原體（mycoplasma）是一類(lèi)沒(méi)有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過(guò)濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物，大小為0.1～0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀，故稱(chēng)為支原體。支原體廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，大多對(duì)動(dòng)物不致病，但是對(duì)人致病的支原體。

        支原體的革蘭染色為陰性，但不易著色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原體主要以二分裂方式繁殖，亦可以出芽方式繁殖，分枝形成絲狀后斷裂呈球桿狀顆粒。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢，適宜生長(zhǎng)溫度為35℃，最適pH值為7.8～8.0。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成典型的“荷包蛋”狀菌落。支原體抵抗力較弱，對(duì)熱、干燥敏感，對(duì)75%乙醇、煤酚皂溶液敏感，對(duì)紅霉素、四環(huán)素、螺旋霉素、鏈霉素、卡那霉素等藥物敏感，但對(duì)青霉素類(lèi)的抗生素不敏感。臨床上支原體致病性較弱，一般不侵入血液，但可通過(guò)黏附作用與宿主細(xì)胞結(jié)合，從細(xì)胞膜獲取脂質(zhì)，使細(xì)胞膜損傷。溶脲脲原體可分解尿素放出大量的氨，對(duì)細(xì)胞有毒害。

        細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實(shí)驗(yàn)器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。同時(shí)，由于支原體直徑很小，僅在0.1～0.3微米之間，只有通過(guò)電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實(shí)驗(yàn)者肉眼發(fā)覺(jué)。而支原體污染是個(gè)循序的過(guò)程，普通抗生素對(duì)其無(wú)效。因此，被支原體污染的細(xì)胞會(huì)持續(xù)受到影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

        支原體檢測(cè)試驗(yàn)的原理是根據(jù)特定序列設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增后用瓊脂糖電泳檢測(cè)是否能跑出條帶：

        原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在Mycoplasma 各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大差異的部分。本制品是在編碼16S 和23SrRNA的DNA 上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1 引物，擴(kuò)增編碼16S 和23S rRNA 的DNA 間隔區(qū)。此反應(yīng)體系只特異性擴(kuò)增Mycoplasma DNA，檢出靈敏度與特異性都很高。

        通過(guò)對(duì)支原體特定的序列設(shè)計(jì)引物，當(dāng)存在支原體污染時(shí)通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增，會(huì)將目標(biāo)DNA特異性地復(fù)制，然后通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)，會(huì)跑出條帶出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。反之當(dāng)沒(méi)有支原體污染時(shí)，由于沒(méi)有模板，PCR無(wú)法擴(kuò)增，則瓊脂糖電泳跑不出條帶，出現(xiàn)陰性結(jié)果。

        同時(shí)在取細(xì)胞樣本進(jìn)行支原體檢測(cè)時(shí)要注意：

        1、取待檢樣本：

        一般是接種后進(jìn)行 3-6d細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)上清液；

        如果使用 Eagle 等常用的細(xì)胞培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)上清可直接加入到 PCR 反應(yīng)液中；

        如果使用細(xì)胞懸濁液作為樣品，則需要提取 DNA，再進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。    

        2、一定要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（一般采用帶有支原體特異片段的質(zhì)粒）與陰性對(duì)照（H2O）；

        3、配制PCR反應(yīng)體系時(shí)需在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，避免污染。

        希望大家在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)永遠(yuǎn)不會(huì)在自己的培養(yǎng)基檢測(cè)到支原體這種小小的原核生物，如果您正好有細(xì)胞需要進(jìn)行支原體檢測(cè)外包的話(huà)普拉特澤生物義不容辭！后兩期支原體檢測(cè)的詳細(xì)操作步驟與細(xì)胞被支原體污染后的處理方法~下期見(jiàn)~