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        Th細胞亞群檢測步驟由普拉特澤生物為大家總結分享。上期小編給大家介紹了淋巴細胞亞群檢測的原理與臨床意義，忘記可以回去復習。本期小編為大家分享的是以T細胞亞群為例的淋巴細胞檢測實驗步驟與方法，普拉特澤生物流式檢測平臺承接流式檢測實驗服務上百例，長期提供穩(wěn)定專業(yè)的淋巴細胞亞群檢測外包服務，歡迎咨詢。

        細胞亞群的檢測方法種類繁多，大多都是根據細胞表面抗原及其抗體的特異性反應設計的。隨著單克隆抗體的問世及各種檢測方法的建立，淋巴細胞亞群檢測已經在臨床上得到廣泛應用。目前，流式細胞術（FCM）為淋巴細胞亞群檢測的標準方法。

        那么現(xiàn)在跟小編一起來看看，以人血和小鼠Th細胞亞群為例檢測的操作步驟吧~

        1、外周血單個核細胞的分離:取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5mL。在試管內加入淋巴細胞分離液3mL將外周血以等體積Hanks液稀釋后，輕輕加入淋巴細胞分離液上層。2000g離心20 min。取出試管后，輕輕吸取液相交界的單個核細胞,加入Hanks液3mL混勻后，1500g離心5 min。棄去上清，細胞加入0.5mLRIMI1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清，50ug/mlpenicillin和50ug/mlsteptomycin)重懸，血細胞計數儀計數，調整細胞濃度。

        2、不同濃度的HMA刺激后人T淋巴細胞CD4D8和CD3的表達。24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5x10⁵個細胞，加入RPMI1640培養(yǎng)基至總體積1mL。加入不同濃度的HMA(10ng、20ng和50ng終濃度)和500ngmlIonomycin共同刺激人外周血單個核細胞同時加入0.7uLGolgistop37℃O孵箱刺激4h。收集單個核細胞分為三部分，分別加入CD8-CYC CD4-CYC CD3-APC單抗各10uL，室溫避光孵育30 min。加入紅細胞裂解液(FACSLysingSolution)lml裂解殘余紅細胞，2m1PBS洗滌細胞一次。流式細胞儀(FACSCaliburBectonDickinson)檢測細胞,Cellquest軟件獲取分析細胞，每個檢測獲取10000個細胞。采用前向角(FSC)和側向角(SSC)散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以直方圖分別表示CD3、D8和D4陽性淋巴細胞。

        3、不同時間HMA和離子霉素刺激后小鼠T淋巴細胞CD4和D的表達。24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入約5x105個細胞，加入RHMI1640培養(yǎng)基至總體積1mL。加入HMA和Ionomycin使終濃度分別為100ng/ml和1ug/ml，同時加入0.7μLGolgistop。37度二氧化碳孵箱刺激8h 12h分別收集細胞。采用抗小鼠CD4-CYCCD8PE抗體標記T淋巴細胞，流式細胞儀檢測CD4和CD8的表達。

        4、流式細胞術檢測人外周血Th1和Th2細胞。分離外周血單個核細胞，加入20ng/mlPMA和500ng/ml離子霉素刺激4h后，收集細胞。將細胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，分別加入CD3-APCCD8-PercP10uL，混勻，室溫放置20 min，加入紅細胞裂解液lmL混勻，室溫放置10 min，1000g離心5 min，棄上清。加入Cytofix/Cytopemm液200μL，4℃放置20 min，使細胞固定穿孔。加入PemWash液lmL1500g離心5 min，棄上清。實驗管加入IFN-V-FITCIL-4-PE各5ul，對照管加入同型對照抗體，4℃避光孵育30 min。加入PemWash液500μL洗滌兩次。最后以300ul洗滌液重懸細胞。采用FACScom軟件及CD3-APCCD8-PercP、IFN-V-FITC、IL-4-PE抗體單雙標記的淋巴細胞調節(jié)儀器的補償，采用Cellquest軟件獲取分析細胞。以前向角(FSC)和側向角(SSC)散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以D3和D8散點圖設門區(qū)分Th細胞(D3+D8)。最終以IFN-y和IL-4的散點圖表示Th1細胞和Th2細胞。

        5、流式細胞術檢測小鼠外周血Th1和Th2細胞。分離外周血單個核細胞，加入100ng/mlPMA和1ug/ml離子霉素刺激5h后，收集細胞。將細胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，加入CD4-CYC10ul，混勻，其余步驟同人的檢測。調節(jié)儀器的補償，采用Cellquest軟件獲取分析細胞。以前向角(FSC)和側向角(SSC)散射光散點圖設門區(qū)分淋巴細胞，以CD4直方圖設門區(qū)分Th細胞(D4)，以IFN-v和IL-4的散點圖表示Th1細胞和Th2細胞。

        那Th淋巴細胞亞群檢測步驟就講完啦，如果您還有其他的檢測方法或有淋巴細胞亞群檢測外包的需求歡迎隨時留言~咱們下個實驗見！