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   大家好！今天我們分享的就是分子檢測(cè)中的CHIP實(shí)操注意事項(xiàng)，本文由普拉特澤生物分子檢測(cè)平臺(tái)為大家總結(jié)分享。CHIP作為咱們的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，也已經(jīng)接了無(wú)數(shù)個(gè)外包的CHIP實(shí)驗(yàn)了，每次實(shí)驗(yàn)前總是有人跟技術(shù)吐槽，明明我就是照著人家操作步驟做的呀，為什么我的結(jié)果就出不來(lái)或者一點(diǎn)都不理想呢？難道人家分享步驟的時(shí)候缺了一點(diǎn)獨(dú)門(mén)秘方不外傳的嗎？

   本文從培養(yǎng)基內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量、交聯(lián)時(shí)間長(zhǎng)短、消化后的片段大小、抗體的種類(lèi)和特異性、常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)等六個(gè)方面給大家詳細(xì)講解chip實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中的注意事項(xiàng)，讓大家都能做好CHIP實(shí)驗(yàn)，得到一個(gè)好的結(jié)果。

   首先，活細(xì)胞的數(shù)量。

   研究的DNA-蛋白豐度直接決定了CHIP實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞數(shù)量，沒(méi)有固定的數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，這些都需要預(yù)實(shí)驗(yàn)充分摸索。活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，如果最終用于CHIP實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)量太高，將直接導(dǎo)致甲醛交聯(lián)時(shí)間增加，間接導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例增大，這些均可造成裂解的DNA小片段過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)1000bp），實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中極易丟失這些片段，最終也會(huì)造成PCR檢測(cè)困難或失敗。最佳的DNA片段長(zhǎng)度是150bp-300bp。相反，如果過(guò)細(xì)胞數(shù)量太少，則導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量/微球菌核酸酶比例減小，最終得到的DNA片段極可能小于100bp。

   然后，甲醛交聯(lián)時(shí)間。

   1%終濃度的甲醛交聯(lián)時(shí)間推薦5-6分鐘。時(shí)間過(guò)久，會(huì)造成裂解的DNA小片段過(guò)長(zhǎng)（超過(guò)1000bp）。時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)不完全，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中導(dǎo)致一部分的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物分離，最終分析的結(jié)果必然是不準(zhǔn)確的。

   第三，對(duì)照組的設(shè)置。

   CHIP實(shí)驗(yàn)內(nèi)對(duì)照：染色質(zhì)斷裂后，須按一定比例留取部分染色質(zhì)溶液，此Input DNA（斷裂后的基因組DNA）作為CHIP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照。內(nèi)對(duì)照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果。如果按照取樣比例換算，還可以根據(jù)Input DNA中靶序列的含量和染色質(zhì)沉淀中的靶序列含量，推算CHIP實(shí)驗(yàn)效率，所以Input內(nèi)對(duì)照是必須要設(shè)置的。

   陽(yáng)性抗體對(duì)照：目的抗體沉淀DNA-蛋白復(fù)合物時(shí)，必須需設(shè)置陽(yáng)性抗體對(duì)照組。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的、各物種之間比較保守的蛋白抗體，常用組蛋白抗體。

   抗體陰性對(duì)照：目的抗體沉淀蛋白DNA復(fù)合物時(shí)，必須需設(shè)置陰性抗體對(duì)照組。陰性對(duì)照所使用的抗體可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白。

   第四、目標(biāo)蛋白抗體

   CHIP實(shí)驗(yàn)中，一定一定要使用已經(jīng)過(guò)CHIP驗(yàn)證的抗體，因?yàn)?/span>染色質(zhì)沉淀步驟時(shí)，蛋白和DNA處在交聯(lián)狀態(tài)，目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)形成空間阻礙，導(dǎo)致抗體無(wú)法與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。此外，抗體的濃度、孵育時(shí)間、孵育溫度需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度決定。目標(biāo)蛋白豐度較低時(shí)，可能需要調(diào)整活細(xì)胞數(shù)量、過(guò)夜4℃孵育等。

   第五、常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作

   CHIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程較長(zhǎng)，過(guò)程繁瑣，需要反復(fù)的洗柱、離心、吸液、換管、孵育、震蕩。操作說(shuō)起來(lái)很簡(jiǎn)單，但是每一步都需要小心操作，非常考驗(yàn)基本功，希望大家多多注意。

   第六步、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

   對(duì)于Input DNA組，采用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果應(yīng)該是片段集中于150bp到350bp之間，這樣長(zhǎng)度的DNA片段才是符合要求的。進(jìn)一步，內(nèi)對(duì)照組、陰性抗體對(duì)照組、陽(yáng)性抗體對(duì)照組的純化DNA先采用PCR擴(kuò)增，隨后通過(guò)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，得到的結(jié)果應(yīng)該是這樣的：空白對(duì)照組無(wú)條帶、陰性抗體對(duì)照組條帶若或無(wú)、內(nèi)對(duì)照組強(qiáng)條帶、陽(yáng)性對(duì)照組看到強(qiáng)條帶。只有這樣的結(jié)果才是成功的。后續(xù)才能進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。

   滴滴滴，CHIP實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng)我們就講完啦！只有把這六個(gè)方面全部抓住，你的chip結(jié)果才能好看又高質(zhì)，如果您覺(jué)得有難度，普拉特澤也可以給您代做CHIP實(shí)驗(yàn)哦，一定能給您交出一份滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，您想自己親力親為我們也給大家準(zhǔn)備了視頻教程，點(diǎn)擊《CHIP 實(shí)驗(yàn)理論+實(shí)操》趕緊學(xué)起來(lái)吧！