動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)詳細(xì)步驟【細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包】
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)詳細(xì)操作步驟由普拉特澤生物總結(jié)平臺(tái)分享。普拉特澤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)專業(yè)提供各類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包服務(wù),細(xì)胞的分離培養(yǎng)傳代作為所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)讓然是不在話下,傳代培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一,也是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),上期我們以小鼠為例介紹了原代細(xì)胞取材培養(yǎng)的操作步驟,今天咱們就來看看和傳代細(xì)胞的培養(yǎng)是哪些步驟跟注意事項(xiàng)吧!
動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟如下:
1、觀察培養(yǎng)基是否正常,細(xì)胞狀態(tài)如何,細(xì)胞密度如何,決定是否傳代。觀察時(shí)擰緊蓋子。
2、加熱PBS、versene、培養(yǎng)基,(提前做好) 瓶子不要倒著放,不要讓液體接觸到瓶塞。
3、打開超凈臺(tái)(先開風(fēng)機(jī),后開照明),用75%乙醇清潔臺(tái)面,點(diǎn)燃酒精燈。不要把廢液缸拿出去倒,如果廢液太多,可以用其他容器先裝廢液。取小離心管一個(gè),置于架子上。
4、取尖吸管、吸量管各一支,放置在專用的架上。放置的方式,注意吸管、吸量管前端都不要與架子接觸。
5、取待傳代的細(xì)胞。打開versene,用酒精燈外焰燒。燒吸管時(shí)距離酒精燈心遠(yuǎn)些,不要把渣滓?guī)нM(jìn)去。把試劑拿入臺(tái)子的時(shí)候,盡量平穩(wěn),不要讓試劑碰到瓶口。
6、用吸量管吸取舊的培養(yǎng)基,置離心管中,吸量管加入versene,然后將versene瓶收起來。(加versene主要是為了將舊培養(yǎng)基洗去)。在離心管中間部分將液體加入。吸液體和加液體時(shí)都不要對(duì)著細(xì)胞。
7、打開胰酶,然后將versene棄掉。換新管,用尖吸管吸取適量胰酶加入。加胰酶后,盡快放平,使細(xì)胞消化時(shí)間一致。
8、將細(xì)胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶,打開PBS. 之后拿出來鏡下隨時(shí)觀察。使用二次消化法,去除容器中殘余的細(xì)胞,別忘了用舊培養(yǎng)基中和。
9、取細(xì)胞,鏡下觀察消化情況。消化程度合適之后(細(xì)胞變圓,但不漂起),用尖吸管棄去胰酶,取離心管中的培養(yǎng)基加入細(xì)胞,吹打,至所有細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部脫落下來。用PBS洗細(xì)胞,versene對(duì)細(xì)胞有毒性,且不能被血清中和。然后吸取至離心管中,800 rpm離心5分鐘。
10、吸量管吸取適量培養(yǎng)基加入新的培養(yǎng)皿中。
11、細(xì)胞離心畢,用吸新培養(yǎng)基的管棄去上清,先把泡沫吸走。換吸量管吸取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基適量,加入離心管,小體積混勻,將細(xì)胞重懸,尖吸管吹勻。
12、擦計(jì)數(shù)板,用槍吸10ul的液體,計(jì)數(shù)。不要把槍伸到離心管內(nèi)。
13、吸量管吸取細(xì)胞懸液,加入新的培養(yǎng)皿中。鏡下觀察,搖勻,放入37度孵育。收超凈臺(tái)。
那動(dòng)物細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要注意哪些注意事項(xiàng)呢?
1、嚴(yán)格保證無菌操作:細(xì)胞離體后非常脆弱,容易被細(xì)菌、真菌、支原體等感染,且細(xì)菌生存能力強(qiáng),一般的細(xì)菌傳一代只有十幾分鐘而細(xì)胞卻需要好幾天,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被細(xì)菌消耗殆盡,而且細(xì)菌等在生長(zhǎng)過程中分泌的毒性也會(huì)造成細(xì)胞的死亡,使傳代失敗。
2、控制消化時(shí)間:細(xì)胞消化過度會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)一部分細(xì)胞損傷和死亡,如果細(xì)胞團(tuán)中都是死細(xì)胞,則不會(huì)貼壁;如果細(xì)胞團(tuán)中仍存在有活力的細(xì)胞,就會(huì)貼壁造成局部細(xì)胞密度不均勻,該局部較快形成中央壞死細(xì)胞區(qū),難以培養(yǎng)傳代失敗。
3、及時(shí)關(guān)注細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài):日常觀察培養(yǎng)液的顏色與透明度、細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞污染的觀察及防治、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
好啦,動(dòng)物細(xì)胞的傳代細(xì)胞培養(yǎng)詳細(xì)的操作步驟咱們就全部講完了,如果您有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包代做或關(guān)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有相關(guān)的技術(shù)問題需要咨詢的話歡迎給咱們留言,細(xì)胞平臺(tái)的技術(shù)小哥哥姐姐非常樂意給大家進(jìn)行技術(shù)上的交流與科研上的協(xié)助!
那我們下期見~
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