做骨穩(wěn)態(tài)研究，總離不開這幾個關鍵詞：成骨、成脂、成軟骨、增殖、分化、凋亡。成骨及破骨細胞的增殖、分化和凋亡最終決定骨形成及骨吸收，共同構建骨穩(wěn)態(tài)平衡。

今天帶大家讀一篇機制不復雜，但思路很清晰，邏輯較嚴密的骨穩(wěn)態(tài)文章。

其實小編一直是很喜歡看骨科相關的研究文章的，沒別的原因，就是染色好看！

分享一些小編的骨組織染色案例

文獻：

Title：Cytl1通過調節(jié)間充質干細胞的成骨和破骨細胞生成來調節(jié)小鼠的骨穩(wěn)態(tài)

關鍵詞：Cytl1、間充質干細胞、骨穩(wěn)態(tài)

以前的研究表明，敲除Cytl1（Cytl1-/-）的小鼠表現出正常的軟骨內骨化和長骨發(fā)育。本文中，作者研究了Cytl1在骨穩(wěn)態(tài)中的潛在功能，發(fā)現Cytl1?/? 小鼠的骨量比野生型同窩小鼠高，并且抵抗卵巢切除誘導的骨吸收。

作者研究了Cytl1在骨髓干細胞的成骨和破骨細胞生成中的功能，發(fā)現在人間充質干細胞（hMSCs）的成骨過程中，Cytl1被下調。Cytl1能夠通過抑制RUNX2從而降低成骨作用，促進未分化hMSCs的增殖，也刺激成骨分化細胞的凋亡。Cytl1?/?敲除小鼠表現出對破骨細胞活性的抑制和巨噬細胞的破骨細胞生成。這些結果共同表明：

1、Cytl1抑制RUNX2從而抑制成骨分化，促進未分化的hMSCs增殖，促進已分化的hMSCs凋亡。

2、Cytl1?/?敲除抑制破骨細胞的生成和活性。

總結：Cytl1負調節(jié)hMSCs的成骨分化，并正調節(jié)破骨細胞生成及小鼠骨量。

在骨穩(wěn)態(tài)的研究中，尤其是間充質干細胞的三系分化檢測中，有幾項常見的染色技術羅列如下：

另外還有破骨細胞的TRAP染色，軟骨組織的番紅固綠染色等。

有相關染色需要的甲方爸爸們可趁著618 和3周年慶期間來跟我們薅羊毛。

正文開始，我們來過一下本文的結果呈現，然后好好學習一下別人是怎么把一個基因的功能坐實的。

作者首先通過檢查Cytl1?/? 小鼠和WT同窩小鼠的骨量來檢查Cytl1是否調節(jié)長骨的體內平衡。與WT同窩小鼠相比，Cytl1?/? 小鼠的骨量增加，骨小梁體積和骨小梁厚度增加，同時伴隨小梁分離減少，Cytl1?/? 小鼠的小梁數和每個骨周長的成骨細胞數也顯著高于WT同窩小鼠。

這些結果表明，Cytl1功能的喪失會誘導小鼠骨量的增加。為進一步闡明Cytl1在骨穩(wěn)態(tài)中的體內意義，作者檢測了小鼠Cytl1敲除是否可以減輕卵巢切除（OVX）誘導的骨吸收。正如預期的那樣，卵巢切除的WT小鼠股骨遠端的μCT分析顯示骨小梁骨丟失，Cytl1-/-缺失組小鼠骨小梁相對正常，但兩組之間皮質骨沒有顯著差異。

接著，為了闡明Cytl1對骨量調節(jié)的可能機制，作者將hMSCs分別誘導分化為軟骨細胞，脂肪細胞和成骨細胞（也就是我們前文所說的三系分化），QPCR檢測Cytl1的mRNA水平。結果顯示：在hMSCs的成軟骨過程中，Cytl1的表達瞬時增加，但在成脂期間減少，并一直保持在低水平直至分化的晚期。相反，Cytl1表達在早期顯著降低成骨的階段，并且在分化的晚期階段表現出輕微的恢復。

Cytl1的差異表達模式表明它可能在hMSCs的三系分化期間發(fā)揮不同的功能。作者通過用編碼人Cytl1（Ad-Cytl1）的腺病毒感染hMSC細胞過表達Cytl1，再次誘導細胞進行三系分化。發(fā)現過表達Cytl1不影響軟骨形成或脂肪形成。通過成骨誘導培養(yǎng)第18天的茜素紅染色確定，Ad-Cytl1的感染劑量依賴性地抑制hMSC的成骨。當進一步檢查Cytl1是否調節(jié)hMSCs表型轉化時，FACS（熒光激活細胞分選）分析結果顯示Cytl1的過表達不影響hMSCs標記物：CD29，CD44和CD90的表達。這表明：Cytl1負調節(jié)hMSCs的成骨分化，但不影響成軟骨或成脂分化。且這一調節(jié)作用并不引起hMSCs的表型變化。

接下來作者檢查了Cytl1敲低對hMSC成骨的影響。人Cytl1基因特異shRNA慢病毒感染MSCs。通過茜素紅染色和培養(yǎng)第18天的礦化定量評估發(fā)現，Cytl1的敲低顯著促進成骨作用，且敲除Cytl1不影響hMSC標記物CD29，CD44和CD90表達水平。敲低實驗進一步支持了之前的結果，即：Cytl1負調節(jié)MSCs的成骨作用而不影響其基礎MSC表型。

BrdU增殖檢測發(fā)現，Ad-Cytl1過表達或Cytl1重組蛋白處理的MSCs中增殖能力顯著提升，而shRNA介導的Cytl1敲低則抑制增殖。Cytl1上調表達增加了AKT和GSK3β的激活磷酸化從而促進增殖，而用LY294002或Wortmannin處理（AKT特異性抑制劑）MSCs細胞劑量依賴性的消除了AKT對增殖的刺激作用。說明：Cytl1通過AKT信號途徑促增值。

與未分化的hMSCs中的這些作用相反，在已經骨生成分化的MSCs中過表達Cytl1（第3天和第7天）并不會影響AKT或GSK3β的磷酸化。然而，MTS檢測結果則顯示，在已經成骨分化的hMSCs細胞中過表達Cytl1細胞存活率顯著降低。在第7天和第14天，由于Cytl1在成骨分化的hMSC中過度表達，TUNEL陽性凋亡細胞的數量顯著增加。同時發(fā)現，Cytl1的過表達顯著增加BAX的蛋白水平而不影響B(tài)CL2的蛋白水平。鑒于BAX/BCL2的比例決定了對細胞凋亡的易感性，BAX 蛋白水平的這種增加表明：Cytl1過度表達的成骨分化hMSCs細胞的活力降低，是凋亡增加所引起。此外還發(fā)現在成骨分化的hMSCs中Cytl1過表達顯著增加p53的蛋白水平，說明是p53在這一過程中上調了凋亡蛋白BAX。

通過AKT抑制（LY294002或Wortmannin）或敲低BAX（特異性siRNA）的手段來評估成骨和Cytl1調節(jié)MSCs增殖和凋亡之間的聯系。發(fā)現AKT抑制不會影響Ad-Cytl1誘導的成骨抑制（茜素紅結果），表明AKT信號傳導不直接影響hMSCs的成骨，盡管它可通過促進細胞增殖來增加骨祖細胞的數量。相反，BAX的敲低顯著阻斷了Ad-Cytl1的成骨抑制作用，這清楚地表明Cytl1過表達誘導的BAX上調對于Cytl1調節(jié)的MSCs成骨能力是必需的。

在體實驗結果表明，與WT同窩小鼠相比，Cytl1?/?基因敲除的小鼠骨小梁中TUNEL陽性凋亡成骨細胞的數量顯著減少。所有的結果都表明：Cytl1介導的成骨細胞凋亡調節(jié)路徑在調節(jié)小鼠骨量中的重要作用。最后，作者還證明了Cytl1?/? 小鼠表現出的增加的骨量和對OVX（卵巢切除）誘導的骨吸收的抗性。并發(fā)現Cytl1?/? 小鼠中觀察到的骨量增加，是由破骨細胞生成減少和MSCs的成骨分化增加所導致。

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