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普拉特澤生物承接細胞周期檢測、原代及干細胞鑒定、細胞凋亡檢測等流式相關服務上萬例，積累了操作大量經(jīng)驗

為大家詳細分享巨噬細胞極化實驗結果，同時為廣大科研工作者開展線上的理論培訓與線下實操，可承接流式等實驗外包服務

做免疫實驗的小伙伴，誰還沒“養(yǎng)”過巨噬細胞？

作為我們固有免疫和適應性免疫中的關鍵角色，巨噬細胞簡直是免疫界的“變形金剛”。它們的可塑性極強，能根據(jù)周圍環(huán)境信號，極化成不同的功能亞型。

最經(jīng)典的分型，莫過于M1（經(jīng)典活化）和M2（替代活化）了。

• M1型： 促炎“戰(zhàn)斗機”，負責抗腫瘤、殺病菌。
• M2型： 抗炎“維修工”，負責組織修復、傷口愈合。

為了研究它們，大家通常會從健康人外周血中分離純化出單核細胞，用M-CSF誘導7天，獲得人單核細胞衍生的巨噬細胞（MDMs）。

然后，用不同的“雞尾酒”去刺激它們，使其極化成不同的亞型：

聽起來很簡單？但魔鬼藏在細節(jié)中。

一個靈魂拷問：你一般在刺激后第幾小時去收樣檢測？

是6小時？24小時？還是48小時？

我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，文獻A說24小時能看到某標志物高表達，文獻B說48小時才行，而你自己的實驗結果卻是陰性……

為什么？

因為目前為止，對于這些標志物檢測的“最佳時間點”，業(yè)內根本沒有統(tǒng)一標準！

巨噬細胞的極化是一個高度動態(tài)的過程，不同標志物的表達模式（mRNA和蛋白）隨時間變化極大。如果你在“次優(yōu)”時間點檢測，很可能得到“假陰性”結果，這不僅浪費時間，更可能讓你與真相失之交臂。

為了解決這個大難題，土耳其Duygu Unuvar Purcu等人做了一件“功德無量”的事：他們把M1、M2a、M2c的所有常用標志物，在4h, 8h, 12h, 24h, 48h, 72h 這一系列時間點上，從mRNA到蛋白水平（流式、ELISA）全都測了一遍！

今天，我們就來“抄一下作業(yè)”。

M1型 (促炎“戰(zhàn)斗機”)：手快有，手慢無！

用  刺激后，M1的反應非常迅速，但也非常“精分”。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “急性子” (4小時達峰)： CXCL9, CXCL10, TNF 這三個M1關鍵基因的mRNA水平，在4小時就飆到了頂峰！隨后開始逐漸下降。
• 劃重點： 如果你習慣性地等到24小時或48小時才去收RNA，你看到的只是“峰后殘影”，甚至可能錯過整個表達高峰。
• “穩(wěn)定型” (4小時后穩(wěn)定)： IL-1β 在4小時顯著上調后，能在后續(xù)時間點（直至72小時）都保持穩(wěn)定高表達。
• “晚熟型” (48小時后起飛)： IDO1 是個例外，它的表達隨時間持續(xù)增加，在48-72小時才達到最高值。
• “最奇怪的” (先降后升)： IL-12 的基因表達在4小時反而下降了，直到48小時才開始顯著飆升。

2、蛋白水平 (流式細胞術 & ELISA)

• 流式（表面標志物）：
• CD86 和 HLA-DR 是“短時高峰”，在12小時達到最強，24小時后反而會回落（可能是因為細胞因子IL-10的負反饋調節(jié)）。
• CD64 是最可靠的“晚期”M1表面標志物，從8小時開始上調，24-72小時持續(xù)走高。
• ELISA（分泌蛋白）：
• TNF（腫瘤壞死因子）在4-12小時分泌量最高。
• IL-1β 在8-24小時這個時間窗口檢測最佳。
• IL-12p70 在4小時很低，但在8-72小時都能穩(wěn)定檢測到高水平。

M1小結：M1的反應風風火火。想看基因？4-8小時是黃金時間。想看流式表面蛋白？12小時看CD86/HLA-DR，24小時后看CD64。想看分泌的細胞因子？8-24小時是檢測M1“三巨頭”（TNF, IL-1β, IL-12）的最佳窗口。

M2a型 (修復“醫(yī)療兵”)：耐心，是最大的美德

用  刺激誘導的M2a型，整體反應偏“慢”，需要你耐心等待。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “穩(wěn)步增長型”： MRC1 (CD206) 和 TGM2 在4小時就被誘導，穩(wěn)步增長，直到72小時才達到最高峰。
• “持續(xù)高能型”： CCL17 在所有時間點都保持非常高的表達量。
• “逐漸上量型”： CCL22 從4小時到48小時逐漸增加。
• “驚天逆轉”： 實驗發(fā)現(xiàn)，在  刺激下，IL-10的mRNA水平居然是逐漸下降的！
• 劃重點： 這和很多使用THP-1細胞系（24小時IL-10上調）的報道完全相反！這再次證明了原代細胞和細胞系之間存在巨大差異，做原代細胞不能照搬細胞系的經(jīng)驗！

2、蛋白水平 (流式細胞術 & ELISA)

• 流式（表面標志物）：
• CD200R 和 CD206 (MRC1) 這兩個M2a的“金標準”標志物，都是晚期標志物。它們從8小時開始緩慢上調，在48-72小時達到最高水平。
• 劃重點： 如果你只刺激了24小時就去看CD206，很可能因為表達量不夠高而“假陰性”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 雖然mRNA在M2a中沒有上調，但 IL-10 蛋白 確實分泌了！不過非常晚，在48-72小時才能檢測到顯著水平。

M2a小結：研究M2a表型，“耐心” 是關鍵詞。無論是看流式（CD206/CD200R）還是ELISA（IL-10），都請至少等到48小時，最好是72小時。

M2c型 (抗炎“清道夫”)：mRNA和蛋白的“時差”

用  刺激誘導的M2c型，展現(xiàn)了mRNA和蛋白表達之間巨大的“時間差”。

1、mRNA 水平 (qPCR)

• “早高峰”： IL-10 的mRNA水平在4小時就達到了頂峰。
• “穩(wěn)定型”： CD163 的mRNA在4小時到72小時都維持穩(wěn)定表達。
• “人間蒸發(fā)”： 在所有檢測時間點，均未檢測到TGFβ的基因表達！

2、蛋白水平 (流式細胞術 & ELISA)

• 流式（表面標志物）：
• CD163 蛋白的表達在24-72小時開始增加（盡管存在較大的供體差異）。這與4小時mRNA就穩(wěn)定的情況形成了“時差”。
• ELISA（分泌蛋白）：
• 最大的“時差”來了： 盡管沒有檢測到TGFβ的mRNA，但在72小時，檢測到了非常顯著的TGFβ蛋白分泌！
• 劃重點： 這說明細胞可能早已轉錄好mRNA，或者現(xiàn)有的mRNA已足夠維持蛋白合成，也可能蛋白是合成后積累在胞內，到晚期才集中釋放。千萬不要因為qPCR測不到mRNA，就斷言沒有蛋白功能！

M2c小結：M2c充分展示了科研的復雜性?？磎RNA（IL-10）要趁早（4h），看蛋白（CD163/TGFβ）要趁晚（24-72h）。

終極“抄作業(yè)”指南：黃金時間表（建議收藏）

說了這么多，一張圖（表）總結所有知識點。下次做實驗，請直接對照這張表來安排時間！

表1：人單核細胞衍生巨噬細胞中M1, M2a, M2c極化標志物的建議檢測時間注：nd (no significant upregulation was detected)，未檢測到明顯上調。

總結：

1. 沒有“一刀切”的時間點： M1標志物（特別是mRNA）反應快，M2標志物（特別是蛋白）反應慢。
2. 原代細胞 ≠ 細胞系： M2a中IL-10 mRNA的下降，警示我們不能盲目套用THP-1等細胞系的數(shù)據(jù)。
3. mRNA ≠ 蛋白： M2c中TGFβ的表達差異，提醒我們mRNA和蛋白的檢測結果必須結合分析，不能相互推斷。

有了這份指南，你就可以根據(jù)自己想檢測的特定標志物，精確安排實驗時間，告別“假陰性”，提高實驗的重復性和可比性！

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