譯：RNF 125和Cbl-b對NLRP 3的連續(xù)泛素化抑制炎癥小體活化和緩解內毒素血癥

JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE( IF ：14.307/Q1 )

復制點擊此處直達原文：https://doi.org/10.1084/jem.20182091

【內毒素血癥】：是由于革蘭氏陰性菌細胞壁內的一種脂多糖在細菌死亡后釋放入血液，引起發(fā)熱等一系列的臨床綜合征。

【NLRP3炎性小體】：核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是炎癥小體中關鍵的調控蛋白之一，作為固有免疫的重要組分在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中具有重要作用。

【Cbl-b】：Casitas-B系淋巴瘤蛋白-b (Cbl-b)是一種RING finger E3泛素連接酶，在T細胞活化、耐受誘導和分化中起著至關重要的作用。

【RNF125】：一種E3泛素連接酶，作者額外發(fā)現(xiàn)該酶參與連續(xù)泛素化中。

1、Cbl-b選擇性抑制NLRP3炎性小體

由于存在關于Cbl-b參與單核細胞或巨噬細胞中TLR4或myd88介導的信號通路存在相互矛盾的發(fā)表觀點。因此，作者先確認在TLR配體反應中，Cbl-b是否在促炎細胞因子的產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。

首先用各種TLR配體刺激WT和Cblb - / -骨髓源性巨噬細胞(bmdm)，并測量細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的生成。沒有觀察到任何由TLR4或MyD88減少而引起B(yǎng)MDMs缺乏Cbl-b(圖1 B)。總之，作者的數(shù)據(jù)表明，Cblb不調節(jié)TLR信號。

為了確定Cbl-b是否調節(jié)典型和非典型NLRP3炎癥小體，作者用一些能激活典型和非典型炎癥小體的毒素來引起敲除小鼠相關癥狀，檢測血液中相關炎癥因子。

作者發(fā)現(xiàn)WT和Cblb?/?bmdm在炭疽LT、鞭毛蛋白和poly(dA:dT)刺激下產(chǎn)生的IL-1β無差異;然而,顯著高于ATP, 尼日利亞菌素,和施萊誘導生產(chǎn)的il-1β,(圖1 D)。通過從培養(yǎng)物收集的上清液的免疫印跡顯示，在ATP或CTB刺激下，Cblb?/?BMDMs產(chǎn)生的IL-1β增加與活性Casp-1 p10和成熟IL-1β p17的產(chǎn)生增加相關。

為了確定Cblb是否同時調控典型和非典型NLRP3炎癥小體，作者將NLRP3缺乏和Casp-11缺乏引入Cblb?/?背景，并生成Cblb?/?NLRP3?/?和Cblb?/?Casp11?/?小鼠。作者通過bmdm測量了IL-1β的產(chǎn)生和在lps -啟動和ATP、CTB或EHEC刺激下從WT、Cblb?/?、Nlrp3?/?、Cblb?/?Nlrp3?/?、Casp11?/?和Cblb?/?Casp11?/?小鼠中產(chǎn)生的熱死作用。在ATP和CTB刺激或腸出血性大腸桿菌感染時，NLRP3缺乏可消除Cblb?/?bmdm產(chǎn)生的超il -1β(圖1g，左圖)。相反，Casp-11的缺失只減少了CTB和腸出血性大腸桿菌誘導的超il -1β的產(chǎn)生，而Cblb?/?bmdm誘導的ATP沒有產(chǎn)生(圖1 G，右圖)。腸出血性大腸桿菌誘導的焦亡在WT和Cblb?/?bmdm之間具有可同性，Casp-11缺乏而NLRP3缺乏可顯著抑制焦亡(圖1 H)。作者的數(shù)據(jù)支持這樣一種觀點，即在典型和非典型炎性小體刺激下，Cbl-b調節(jié)Casp-11 -和nlrp3依賴的il -1 β的產(chǎn)生，但似乎沒有調節(jié)EHEC誘導的nlrp3不依賴但Casp-11依賴的自噬過程。（也就是找到了Cbl-b的選擇性調節(jié)）

為了確定在人巨噬細胞中，Cbl-b是否對NLRP3炎性小體激活有類似的作用，作者采用人單核細胞來源的巨噬細胞進行了實驗，，并用cbl-b特異性siRNA轉染MDMs或通過核感染擾亂siRNA。在bmdm中敲除CBLB導致在LPS啟動和ATP刺激下IL-1β產(chǎn)生升高(圖S1)，這些結果表明，Cbl-b在小鼠巨噬細胞NLRP3炎性小體中的作用可轉譯到人巨噬細胞。（效果在人源和鼠源細胞中都得到了印證）這些發(fā)現(xiàn)還表明，

Cbl-b可調節(jié)由Casp-1和Casp-11分別介導的典型和非典型NLRP3炎癥小體。

2、Cbl-b通過Casp-11/ nlrp3依賴的方式抑制lps誘導的亞致死劑量的內毒素血癥

LPS的致死性是由髓系細胞分泌的促炎細胞因子IL-1β介導的，或也可在Casp-11和在非常高的劑量下獨立于TLR4作用。為了測試Cblb是否在體內調節(jié)NLRP3炎癥小體，作者用LPS亞致死劑量(5 mg/kg:B4大腸桿菌;通過腹腔注射）。雖然LPS注射后WT小鼠都存活了24小時，但所有Cblb?/?小鼠都死亡了(圖2a)。Cblb?/?小鼠的血清TNF-α在2小時顯著高于WT小鼠，而IL-1β在注射后2 - 6小時升高。而在WT和cblb?/?小鼠中，血清IL-6水平?jīng)]有差異(圖2b)。為了確定cblb在多微生物膿毒癥中的作用，使用盲腸結扎和穿刺(CLP)誘導的膿毒癥模型。發(fā)現(xiàn)Cblb?/?小鼠對亞致死CLP高度敏感，這與CLP后血液細菌負荷和血清IL-1β升高有關，但與IL-6無關(圖2,C和D)。為了確定在Cblb?/?小鼠中觀察到的白細胞介素-1βIL-1β升高是否是LPS致小鼠死亡的主要原因，作者在LPS刺激前給Cblb?/?小鼠注射IL-1R拮抗劑(IL-1RA)。如圖2a所示，阻斷IL-1R可以防止LPS注射后Cblb?/?小鼠的死亡。這種預防與血清IL-1β和TNF-α水平降低有關，但與IL-6水平無關(圖2b)，這表明IL-1β和TNF-α之間存在正反饋，IL-1β和TNF-α都提高Cblb?/?小鼠的致死率。為了支持這一觀點，作者使用了Cblb?/?Nlrp3?/?動物。NLRP3缺陷完全挽救了cblb?/?小鼠，使其免于由LPS亞致死劑量引起的死亡(圖2g)，這與血清中IL-1β和TNF-α的顯著減少有關(圖2h)。因此，作者的數(shù)據(jù)表明，cblb抑制在體內產(chǎn)生nlrp3依賴的IL-1β，以及在LPS刺激下Cblb - / -小鼠血清中TNF-α的增加可能是繼發(fā)于IL-1β。（IL-1β和TNF-α正反饋，他們的提高可能是LPS誘導的內毒素血癥的主要原因）

為了排除適應性免疫系統(tǒng)對脂多糖誘導的Cblb?/?小鼠致死的潛在混淆效應，作者制備了Cblb?/?Rag1?/?小鼠，該小鼠不含T細胞和B細胞。將亞致死劑量的LPS注射到Rag1?/?Cblb?/?小鼠中，再現(xiàn)了在Cblb?/?小鼠中觀察到的現(xiàn)象(圖S2 a)，表明對典型亞致死劑量LPS的致死主要是由固有免疫細胞產(chǎn)生的IL-1β介導的。為了進一步證實這一點，作者制備了帶有Cblb等位基因(Cblbf/f;圖B S2),缺乏Cbl-b骨髓細胞譜系的交叉LysM Cre老鼠(LysM Cre-Cblbf / f）;確實，亞致死劑量的LPS誘導LysM crec - cblbf /fmice的高死亡率(圖S2 C)，從而再現(xiàn)了在Cblb?/?小鼠中觀察到的現(xiàn)象。在表達E3泛素連接酶死亡突變的小鼠中也發(fā)現(xiàn)了類似的結果(C373A;2 I)，提示Cbl-b對lps誘導的內毒素血癥的抑制依賴于其E3泛素連接酶活性。綜上所述，作者的數(shù)據(jù)表明，髓系細胞中Cbl-b的E3泛素連接酶活性抑制NLRP3炎性小體介導的內毒素血癥。（找到Cbl-b是泛素化作用來抑制內毒素血癥的）

此前的研究表明，lps誘導的致死劑量致死率依賴于Casp-11誘導的焦亡，而不是Casp-1。為了確定Cblb是否也能調節(jié)致死劑量LPS誘導的致命性，作者給WT、Cblb?/?、Casp11?/?、Nlrp3?/?、Cblb?/?Nlrp3?/?和一個dCblb?/?Casp11?/?小鼠注射致死劑量(54 mg/kg) LPS。WT, Cblb??,Nlrp3??,andCblb??/ Nlrp3??/老鼠死后14小時內注射以相似的速度(圖2 J,左面板),Casp11 /??和Cblb /??Casp11??/小鼠從注入第一個16 h后存活(圖2 J)。注射LPS 20毫克/公斤,WT、Cblb??,Casp11??、Nlrp3??,Cblb??/ Casp11??、N d Cblb??/ Nlrp3??/老鼠顯示缺乏Nlrp3和Casp-11的血清中IL-1β水平的Cblb??/老鼠(圖2 K)。總的來說,這些數(shù)據(jù)表明,Cbl-b調節(jié)Casp-11 / NLRP3炎癥小體激活,它觸發(fā)IL-1β的產(chǎn)生，但它不調節(jié)nlrp3獨立，但casp -11依賴的非典型炎癥小體激活，主要引發(fā)焦亡。（致死量救不活了，那就研究亞致死量吧~）

3、在NLRP3炎性小體激活的巨噬細胞中，Cbl-b與NLRP3相關

最近的研究表明NLRP3炎癥小體受蛋白質泛素化依賴機制的調控，但泛素化NLRP3的E3泛素連接酶(s)尚未被完全描述。以上數(shù)據(jù)表明，Cbl-b對NLRP3炎性小體具有負向抑制作用。為了確定Cbl-b是否泛素化NLRP3，作者首先確定Cbl-b是否物理上與NLRP3 相連接。作者通過瞬時轉染在HEK293T細胞中表達血凝素(HA)標記的Cbl-b和flag標記的NLRP3。HEK293T細胞缺乏P2X受體，吞噬能力較低，使其對一些nlrp3激活刺激(如ATP和結晶物質，如尿酸單鈉和明膠)相對抵抗。因此，尼日利亞紅蛋白作為一種離子載體，通過脂質雙分子層催化電中性鉀/質子交換，誘導NLRP3激活。免疫沉淀flag標記的NLRP3，然后用抗ha抗體進行WB，表明在HEK293T細胞中，Cbl-b與NLRP3相互作用(圖3 A)。為了確定Cbl-b - NLRP3關聯(lián)是否需要ASC，作者使用RAW264.7細胞進行共免疫沉淀(Co-IP)檢測。

這里說明一下，凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）是炎性小體中連接胞漿內受體和半胱天冬酶-1的接頭蛋白，在炎性小體活化中ASC聚集成大分子的二聚體，被稱為ASC斑點（ASC-speck）。ASC斑點的形成對半胱天冬酶-1的活化至關重要，調控ASC斑點的形成是炎性小體相關疾病的治療和預防的新途徑。

在LPS/ATP刺激下，缺乏ASC的小鼠巨噬細胞Cbl-b與NLRP3相關(圖3b)，表明它們的關聯(lián)與ASC無關。為了驗證Cbl-b與內源性NLRP3相互作用，作者使用來自C57BL/6小鼠的bmdm進行了Co-IP。同樣，在LPS啟動和ATP刺激下，Cbl-b與NLRP3結合(圖3c)

（此番大費周章就是為了判斷Cbl-b與NLRP3泛素化連接，沒有之一）

為了確定NLRP3的哪個結構域與Cbl-b相互作用，作者用flag標記的NLRP3及其突變體轉染HEK293T細胞(圖3 D，上圖)。如圖3中、下圖所示，NLRP3與Cbl-b的相互作用依賴于NLRP3的LRR結構域。最后，作者研究了Cbl-b的哪個結構域與NLRP3的LRR結構域結合。通過使用如圖所示的一系列Cbl-b截斷片段。3e，作者發(fā)現(xiàn)Cblb的UBA區(qū)域的缺失使Cblb與NLRP3的結合失效，表明Cblb的UBA區(qū)域與NLRP3的LRR區(qū)域結合。為了確認Cbl-b UBA區(qū)域是否直接與NLRP3的LRR結構域結合，作者將flag標記的NLRP3 LRR或NLRP3ΔLRR與ha標記的Cbl-b UBA一起轉染HEK293T細胞。確實，Cbl-b UBA區(qū)域直接與NLRP3 LRR結構域結合(圖3f)。為了確定Cbl-b UBA是否與NLRP3 LRR結構域上的泛素鏈結合，作者對LRR結構域內的所有11個賴氨酸殘基進行了突變。作者發(fā)現(xiàn)NLRP3 LRR K/R突變體未能與Cbl-b結合(圖3g)，因此支持了Cbl-b UBA區(qū)域與NLRP3 LRR結構域上的泛素鏈結合的模型。用Nlrp3 LRR K/R突變體重組Nlrp3?/?bmdm導致IL-1β產(chǎn)量增加，這進一步支持了這一觀點(圖3h)。（通過位點突變的方法，找到Cblb的UBA區(qū)域與NLRP3的LRR區(qū)域直接連接的證據(jù)~）

4、Cbl-b以NLRP3為靶點進行泛素化和蛋白酶體介導的降解

為了評估Cbl-b是否針對NLRP3進行泛素化，作者用flag標記的NLRP3、his標記的泛素以及ha標記的缺乏E3泛素連接酶活性的Cbl-b或Cbl-b C373A突變體轉染HEK293T細胞。確實，Cbl-b而不是Cbl-b C373A增強了NLRP3泛素化(圖4 A和圖S3 A)。為了進一步證實Cbl-b是NLRP3的E3泛素連接酶，WT和Cblb C373A BMDMs被LPS激活并被ATP刺激。在來自CblbC373A小鼠的bmdm中，NLRP3泛素化顯著降低(圖4 B和圖S3 B)。這些數(shù)據(jù)表明，cblb通過泛素化NLRP3抑制NLRP3炎癥小體。接下來，作者使用K48和k63特異性泛素抗體確定NLRP3是否經(jīng)歷K48或k63連接的多聚泛素化。事實上，WT bmdm的NLRP3同時經(jīng)歷了K48和k63相關的多聚泛素化。令人驚訝的是，盡管在表達Cbl-b C373A的bmdm中NLRP3的K48鏈接泛素化減弱，但NLRP3的k63鏈接泛素化仍未改變(圖4 B和圖S3 B)。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，作者用ha標記的Cbl-b和flag標記的NLRP3，以及his標記的泛素，K48泛素，或K63泛素。與之前的一份報告一致，NLRP3接受K48和K63-連接多次泛素化(圖4 C和S3 C)。作者的數(shù)據(jù)表明,Cbl-b介導K48連接的多次泛素化，但K63連接的NLRP3和泛素化的NLRP3 HEK293T細胞中觀察到CblbC373A BMDMs可能是由于額外的內生E3泛素連接酶。（這里發(fā)現(xiàn)可能有個額外的泛素化連接酶，介導了Cbl-b和NLRP3的連接，因此引出下一章）為了確定NLRP3泛素化的功能意義，作者將WT bmdm以LPS為基礎，用ATP刺激或感染EHEC，在存在或不存在MG-132(蛋白酶體抑制劑)或E-64(溶酶體抑制劑)的不同時間點刺激。NLRP3在ATP刺激或EHEC感染時發(fā)生降解，MG-132可阻止NLRP3降解，E-64則不能(圖4 D)。這些結果表明NLRP3的降解依賴于蛋白酶體。這些數(shù)據(jù)支持了Cbl-b是NLRP3的E3泛素連接酶并介導NLRP3降解的觀點。

5、鑒定 RNF125 作為一種新型 E3 泛素連接酶，誘導 K63 連接的 NLRP3 LRR 結構域的泛素化，該結構域招募 Cbl-b

泛素鏈與NLRP3 LRR結構域的連接以及它們與Cbl-b UBA區(qū)域的關聯(lián)表明，除了Cbl-b之外，E3泛素連接酶還參與了NLRP3 k63連接的泛素化起始過程。為了識別引發(fā)NLRP3 LRR泛素化的E3泛素連接酶，作者進行了GST-NLRP3拉下分析和質譜分析。用LPS刺激WT bmdm 4 h，用ATP刺激5min。用LPS刺激但沒有ATP刺激的bmdm作為對照。將BMDM裂解物與GST-NLRP3固定在谷胱甘肽瓊脂糖珠上孵育。用SDSPAGE溶解從微珠中洗脫出來的配合物，并通過銀染色進行分析(圖S4 A)。從微珠中洗脫出來的蛋白被裝載在懸浮捕獲過濾器上，作為一個細小的分散體被胰蛋白酶消化，通過液相色譜-質譜聯(lián)用(LCMS/MS)對產(chǎn)生的多肽進行分析，鑒定nlrp3相互作用蛋白。選擇潛在的E3泛素連接酶是基于LPS引物或LPS引物+ ATP刺激結合NLRP3，概率為>70%。除了Cbl-b,作者確定了幾個額外的E3泛素連接酶包括TRIM213 TRIM21, TRIM47,RNF125和RNF213也綁定NLRP3(圖B S4)。注意在這些候選人中,只有Cbl-b E3泛素連接酶必將NLRP3在ATP刺激(圖B S4)。

進一步驗證這些E3泛素連接酶與NLRP3,他們扮演的角色在NLRP3 炎癥小體激活,Co-IP執(zhí)行實驗來關注上述E3泛素連接酶。這些實驗表明，在LPS啟動和ATP刺激下，TRIM14、TRIM21、TRIM47、RNF213和RNF125在WT bmdm中與NLRP3結合(圖5a)。作者沉默TRIM14 TRIM21, TRIM47, TRIM31, RNF213, RNF125 WT BMDMs。發(fā)現(xiàn)，沉默RNF125，在LPS啟動和ATP刺激下導致IL-1β的產(chǎn)生增加，（找到RNF125這個家伙）數(shù)據(jù)表明，RNF125是最初的E3泛素連接酶，在其LRR結構域內誘導NLRP3 k63連接的多聚泛素化。作者還注意到HEK293T細胞表達可檢測到的RNF125(圖5c)，這可能解釋了為什么NLRP3在不轉染外源性RNF125的情況下也能發(fā)生K63-和k48 -連鎖的多聚泛素化。

為了進一步確定RNF125是否是E3泛素連接酶，誘導k63連接NLRP3在其LRR結構域內的多聚泛素化，作者通過RNF125 siRNA敲除HEK293T細胞中的內源性RNF125，然后用myc標記的RNF125或RNF125環(huán)突變體(RM)轉染這些細胞。其中包含RNF125環(huán)指結構域的C37R和A40M突變，以及在K63泛素存在下flag標記的NLRP3或NLRP3 LRR K/R突變。（RNF125可誘導NLRP3 k63連鎖的多聚泛素化），而這種泛素化在表達RNF125 RM或NLRP3 LRR K/R突變的HEK293T細胞中被取消(圖5C)。為了進一步證實這些數(shù)據(jù)，作者用Rnf125 siRNA沉默WT bmdm中的Rnf125基因，用LPS刺激它們，再用ATP刺激。沉默Rnf125廢除K63連接多次泛素化NLRP3(圖5 D和圖S5 B)來驗證這個結果,采用K63-特異性去泛素化酶AMSH (SH3域相關分子的信號轉導銜接分子),它已被證明特別刪除K63泛素鏈。作者共轉染了ha -標記的Cbl-b、flag -標記的NLRP3、myc -標記的RNF125和his -標記的泛素。細胞裂解液用anti-Flag免疫沉淀，然后用或不用k63特異性去泛素化酶AMSH處理。如圖5 E所示，用AMSH處理Flag免疫沉淀可以消除K63-而不是k48連接NLRP3的多聚泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，RNF125是E3泛素連接酶的起始位點，通過引導k63連接NLRP3 LRR結構域的多聚泛素化。作者發(fā)現(xiàn)RNF125氨基1 - 76片段與NLRP3(圖5 F)。自NLRP3經(jīng)歷K63和K48連接多次泛素化,假設RNF125目標NLRP3遠程結合域K63連接多次泛素化，它連接Cbl-b NLRP3域。為了驗證這一點，用RNF125或RNF125 RM、HAtagged Cbl-b或Cbl-b UBA、flag標記的NLRP3或NLRP3 LRR K/R突變體和he標記的K63泛素轉染HEK293T細胞。發(fā)現(xiàn)K63泛素鏈綁定Cbl-b聯(lián)合NLRP3和K48-連接多次泛素化NLRP3(圖5 G n d H和圖S5 C),進一步支持這一概念,推倒了在WT BMDMs 中Rnf125廢除Cbl-b NLRP3之間的互動，而在沒有Cbl-b的情況下，Rnf125 - NLRP3的相互作用仍然保持完整(圖5,I和J)。此外，沉默Rnf125基因終止了NLRP3的降解(圖5 K)。請注意，沉默Rnf125基因導致NLRP3和pro-IL-1β的表達增加(圖5 L)。這表明RNF125抑制了啟動過程。總之，數(shù)據(jù)表明NLRP3分別經(jīng)歷了由RNF125和Cbl-b介導的K63和k48連鎖多聚泛素化。（實現(xiàn)連續(xù)套娃，RNF125是必不可少的）

6、賴氨酸 496 是將 K48 連接的泛素鏈連接到 NLRP3 的位點

由于NLRP3的LRR結構域經(jīng)歷了k63連接的多聚泛素化，作者推斷Cbl-b介導NLRP3的NBD結構域內k48連接的多聚泛素化。為了確認K496是否是NLRP3的泛素化位點，生成NLRP3 K496R突變體。使用了UbPred：確定了NBD域中的其他四個賴氨酸殘基與低到中等的可能性(K324、K430 K510)， LS-MS / MS分析也檢測到K324和K510(圖6)。包括K437 NLRP3 NBD域中,盡管UbPred顯示了這個賴氨酸殘留沒有可能。作者制備了NLRP3 K324R、K430R、K437R和K510R突變體，并用ha標記的Cbl-b、flag標記的NLRP3或NLRP3 K/R突變體和Histagged的K48泛素轉染HEK293T細胞。NLRP3在K496R位點的突變完全消除了由Cbl-b誘導的NLRP3的k48連鎖多聚泛素化作用(圖6 B和圖S5 D)。用WT NLRP3重組NLRP3?/?bmdm挽救了k48連鎖NLRP3的泛素化作用和隨后的NLRP3降解，說明不是NLRP3 K496R(圖6 C和圖S5 E)。因此，作者數(shù)據(jù)表明Nlrp3 NBD結構域內的賴氨酸496是k48連接的泛素鏈連接位點。（K496是泛素鏈連接位點）

7、體內沉默Rnf125可增加小鼠對LPS亞致死劑量誘導的敗血性休克的敏感性

由于RNF125是NLRP3 LRR結構域與k63相關的多聚泛素化啟動所必需的，它會招募Cbl-b，因此RNF125缺陷的小鼠也可能對脂多糖誘導的內毒素血癥高度敏感，正如Cblb?/?小鼠所顯示的那樣。最近，作者建立了一種在WT小鼠體內沉默Cblb基因的方案。為了驗證這一點，通過尾靜脈注射Rnf125特異性siRNA在體內傳遞來沉默Rnf125基因。與預期一樣，在注射LPS亞致死劑量后，所有接受Rnf125 siRNA的小鼠都在40小時內死亡，而接受對照siRNA的小鼠存活率為60%(圖7a)。這些數(shù)據(jù)表明，Rnf125基因沉默小鼠的表型與在Cblb?/?小鼠中觀察到的表型相似。（用動物實驗進一步驗證RNF125的重要性）