Northern Blot印跡雜交實驗介紹——新人必看
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學整體課題外包平臺
大家好,今天帶大家來認識一個新的實驗——Northern Blot印跡雜交實驗,考慮到上期出了Western Blot之后總有小姐姐來向小編咨詢Northern Blot的各種實驗問題,居然還有朋友連概念都是模糊的,那小編當然是即刻給安排上啦!Northern Blot實驗介紹由普拉特澤生物分子檢測平臺給大家總結(jié)分享,普拉特則專業(yè)提供Northern Blot外包實驗服務(wù),分子檢測平臺成立以來承接了Northern Blot業(yè)務(wù)幾百次,積累了極其豐富實驗操作經(jīng)驗,快來學習吧!
圖片來源《Feedback inhibition of L1 and alu retrotransposition through altered double strand break repair kinetics》
Northern印跡雜交(Northern blot)。這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建,稱為Southern印跡技術(shù),RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng),故被稱為Northern印跡雜交,與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。(鏈接奉上快去學習)
Northern Blot印跡雜交的實驗原理是:整合到植物染色體上的外源基因如果能正常表達,則轉(zhuǎn)化植株細胞內(nèi)有其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——特異mRNA的生成。將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離,則不同的RNA分子將按分子質(zhì)量大小依次排布在凝膠上;將他們原位轉(zhuǎn)移到固定膜上;在適宜的離子強度及溫度條件下,用探針與膜雜交;然后通過探針的標記性質(zhì)檢測出雜交體。若經(jīng)雜交,樣品無雜交帶出現(xiàn),表明外源基因已經(jīng)整合到植物細胞染色體上,但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達。
Northernblot的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性,雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時間再次雜交使用。
那么為什么northern見的比較少呢?
因為實驗需要的RNA量比較大,對一些少量和痕量樣品是很難實現(xiàn)的,因此很多實驗都做反轉(zhuǎn)錄后的定量分析。但事實上除了無法給出realtimePCR那種量化數(shù)據(jù)外(realtimePCR,尤其是間接法的,做過的人應(yīng)該有個概念吧,你標準曲線稍微偏一點點,結(jié)果就有倒過來的可能),Northern的結(jié)果才是最為直接,最可信的結(jié)果,因為cDNA的定量經(jīng)過了反轉(zhuǎn)錄這一步,由于多了一步操作因而也多了一步不確定的因素,而且由于檢測的靶由RNA調(diào)到了DNA,做PCR和雜交時結(jié)果也就會受到genomicDNA的影響(reverse-Northernblot和RT都一樣),另外在雜交實驗中,DNA-RNA,RNA-RNA這兩種雜交雙鏈的穩(wěn)定性是比DNA-DNA穩(wěn)定和嚴格的多的,因此不管是DNA探針還是RNA探針,檢測RNA靶要比檢測DNA靶在嚴謹性上要高很多。因此Northern Blot在材料和技術(shù)上的問題沒辦法做,所以在通過反轉(zhuǎn)錄做cDNA。
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