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    第一章：RNA干擾技術(shù)是什么？

在基因功能研究過程中，我們常常會用到基因干擾技術(shù)。盡管大部分人可能聽說過RNA干擾技術(shù)，但是對它的了解可能還停留在找生物公司合成序列進行實驗（交給生物公司一段序列，然后生物公司合成，寄回合成的干擾RNA，再按照師兄師姐祖?zhèn)飨聛淼膶嶒灢僮鞑襟E像個無情的機器人一樣一步步操作，然后就會發(fā)現(xiàn)：怎么這個東西對我的基因毫無干擾效果啊，然后開始去找生物公司麻煩，要求退款），對這項技術(shù)背后的奧秘卻往往一知半解，更有甚者一無所知。但其實這項技術(shù)不僅揭示了生命體內(nèi)基因表達調(diào)控的復雜性，更為疾病治療、基因編輯等領(lǐng)域帶來了革命性的突破，絕對不僅僅是咱們下個單合成后按照步驟操作那么簡單。那本期文章將帶大家深入了解RNA干擾技術(shù)的起源、發(fā)展歷程、作用機制以及廣泛的應用領(lǐng)域，希望能給剛接觸RNA干擾技術(shù)的小伙伴們提供一些，除蒙著頭做實驗外的一些答疑解惑，同時，也為科研工作者提供一些有價值的參考與啟示

在之前學習中，我們學習了基因表達，如果我們將基因表達比喻為河流中的水流，而基因干擾技術(shù)則如同河流中的調(diào)控閘門。在正常情況下，基因按照其內(nèi)在的邏輯和節(jié)奏進行表達，猶如河流中的水流按照地勢和氣候的自然規(guī)律流淌。然而，當我們需要在某些特定情境下調(diào)節(jié)或阻斷某些基因的表達時，基因干擾技術(shù)便如同調(diào)控閘門一樣發(fā)揮作用。這個調(diào)控閘門通過接收特定的指令（如RNA干擾技術(shù)中的小分子RNA，如siRNA、shRNA或者miRNA），能夠精確地識別并鎖定特定的mRNA分子。一旦這些mRNA分子被鎖定，它們就會被引導至降解途徑，相當于水流被閘門截斷。這樣一來，特定的基因表達就被“閘門”阻擋，實現(xiàn)了對該基因活動的抑制或完全阻斷，從而達到我們期望的調(diào)控效果。

  第二章：RNA干擾現(xiàn)象-生命的自我保護與進化之謎

了解完之后相信大家對于RNA干擾的機制還處于一知半解的狀態(tài)，別著急，接下來我們帶大家一起來學習并參透其中的奧秘。

RNA干擾現(xiàn)象是一種古老而普遍的生命現(xiàn)象。早在1988年代初，科學家們就開始注意到：雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，而后在植物和真菌中相繼發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，科學家們將其命名為RNA干擾。（。之后他們發(fā)現(xiàn)從單細胞生物到復雜的動植物（如秀麗新小桿線蟲、真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚以及人類等真核生物），無一不存在RNA干擾的現(xiàn)象，通過這些結(jié)果，科學家們已經(jīng)認識到，這絕不是小部分的偶然事件，而是生命體中的，一種普遍存在的基因表達調(diào)控機制。因此科學家們開始思考，為什么生物體會進化出RNA干擾這樣的機制呢？這背后究竟隱藏著怎樣的生命奧秘呢？

首先，我們需要從細胞的生活環(huán)境說起。細胞作為生命的基本單位，在漫長的進化歷程中面臨著來自病毒、細菌等外來病原體的不斷侵擾。當?shù)谝粋€被病毒RNA侵擾的細胞出現(xiàn)時，這個幸運的細胞可能恰好擁有一條與病毒RNA互補配對的序列，這條序列就像一把精準的鑰匙，能夠識別并結(jié)合病毒RNA，啟動降解過程，將其轉(zhuǎn)化為無害的碎片。這種偶然但關(guān)鍵的互補配對，為細胞提供了一種自我保護機制，即RNA干擾。而有些倒霉蛋細胞，它們沒有這條“幸運”序列，因此無法有效抵御病毒的入侵，從而更容易被病毒消滅，這也是達爾文自然選擇、適者生存法則在微觀世界的體現(xiàn)。隨著時間的推移，越來越多的細胞發(fā)覺要想不做倒霉蛋，不被病毒RNA消滅，就必須要進化出這種RNA干擾機制。它們不僅能夠識別并降解病毒RNA，還能夠調(diào)節(jié)自身基因的表達，從而適應不同的環(huán)境變化。

在siRNA和shRNA還未發(fā)現(xiàn)之前，RNA干擾的主角是天然存在于生物體內(nèi)的miRNA。前體miRNA經(jīng)過一系列的加工過程最后得到了成熟的miRNA，隨后成熟的miRNA再和特定的蛋白質(zhì)（RISL蛋白）形成了一個RNA誘導的沉默復合體RISC。RISC在細胞質(zhì)中巡邏，尋找著與其攜帶的miRNA互補的mRNA。一旦一個靶mRNA與miRNA形成堿基配對，該mRNA就會瞬間被存在于RISC中的核酸酶降解掉，一旦RISC解決好了一個mRNA分子后，RISC便得到了解放，就可以著手于再去尋找新的mRNA分子，由此高效的阻斷mRNA編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，根據(jù)配對程度的不同，靶mRNA要么在RISC中被核酸酶降解，要么就被轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中被其他的細胞核酸酶所摧毀。

如何來理解這個過程呢？我們可以把RISC復合體看做城市里的特工隊：RISC特工隊在細胞質(zhì)這個繁忙的城市中巡邏，他們的任務(wù)是搜尋那些與miRNA“密碼”相匹配的mRNA“嫌疑犯”。每當RISC發(fā)現(xiàn)一個可以與miRNA配對的mRNA目標時，隊伍中的“核酸酶特工”會立即采取行動。根據(jù)“嫌疑犯”的“罪行”輕重（即配對程度的不同），RISC有兩種處理方式：一種是直接在現(xiàn)場（RISC內(nèi)部）用核酸酶將其“逮捕并銷毀”；另一種則是將其“移送”到細胞質(zhì)的其他區(qū)域，由其他“細胞核酸酶警察”進行進一步的處理和摧毀。一旦RISC成功處理完一個mRNA分子，他們就如同完成了一次任務(wù)，重新整裝待發(fā)，繼續(xù)在城市中巡邏，尋找下一個目標。這樣的工作方式讓RISC能夠高效地阻止mRNA所編碼的蛋白質(zhì)“罪犯”的產(chǎn)生，從而維護細胞內(nèi)的基因秩序和安全。

  第三章：miRNA：諾貝爾生理學獎背后的秘密

在RNA干擾包括許多的小分子RNA如miRNA、siRNA和shRNA，其中miRNA（微小RNA）無疑是最耀眼引人注目的一類。在今年的10月7日，諾貝爾生理學或醫(yī)學獎頒發(fā)給了美國的兩位科學家（Victor Ambros和Gary Ruvkun），他們因發(fā)現(xiàn)microRNA及其在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用而共同獲得這一獎項，這一事件更是將miRNA的研究推向了新的熱潮。那么，miRNA究竟是什么呢？

miRNA是一類長度約為20-25個核苷酸的非編碼內(nèi)源性RNA分子。它們廣泛存在于生物體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)基因的表達來參與多種生物過程。盡管大家可能只知道miRNA能夠與靶基因的3’UTR區(qū)配對并降解mRNA，但miRNA的功能遠不止于此。事實上，miRNA具有多種功能，包括阻止翻譯過程、降低RNA的穩(wěn)定性以及在某些情況下激活翻譯等。

阻止翻譯過程：當miRNA與靶mRNA的3’UTR部分互補配對時，它們會形成一個雙鏈結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)會阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，從而抑制翻譯過程的起始。即使核糖體已經(jīng)與mRNA結(jié)合，miRNA也可以干擾tRNA對密碼子的識別，導致翻譯過程的提前終止。

降低RNA的穩(wěn)定性：除了抑制翻譯，miRNA還可以通過誘導靶mRNA的降解來降低其穩(wěn)定性。這通常發(fā)生在miRNA與靶mRNA的序列部分互補但并非完全互補的情況下。通過結(jié)合特定的酶（如Dicer酶和RISC復合體），miRNA可以引導這些酶對靶mRNA進行切割，從而使其降解。

在某些情況下激活翻譯：近期的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA并非總是抑制翻譯。在某些情況下，它們也可以激活翻譯。這通常發(fā)生在細胞核內(nèi)，通過結(jié)合增強子來激活基因表達，這種miRNA被稱為NamiRNA（nuclear activating miRNA）。然而，這種激活作用的具體機制尚不完全清楚，需要進一步的研究來揭示。

一般來說，這些不同功能的實現(xiàn)，取決于miRNA與靶基因之間的，互補配對的堿基數(shù)目的多少即配對的程度。當miRNA與靶mRNA的3’UTR區(qū)部分互補時，它們就會形成雙鏈結(jié)構(gòu)并抑制翻譯過程；而當miRNA與靶mRNA的序列完全互補時，它們就會直接降解靶mRNA。也就是說互補配對的堿基越多，基因干擾的效果就越好。

然而，我們在實驗過程中會發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象是：當我們在細胞中過表達miRNA后，其QCR（定量反轉(zhuǎn)錄PCR）結(jié)果不顯著，但是蛋白水平卻顯著下降呢？這主要是因為miRNA的作用機制是在轉(zhuǎn)錄后水平上進行調(diào)節(jié)的。即使mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化，miRNA仍然可以通過抑制翻譯過程或降解mRNA來降低蛋白的表達水平。

由于miRNA與靶mRNA之間的堿基配對不需要完全互補，因此它們可以識別并調(diào)節(jié)多個靶基因的表達，也就是說一個miRNA可以對應多個mRNA序列進行干擾和調(diào)節(jié)。同時，miRNA作為內(nèi)源性RNA分子，在細胞內(nèi)的存在和作用更加復雜且微妙，它們可以通過與靶mRNA的結(jié)合來影響其穩(wěn)定性、翻譯效率以及與其他分子的相互作用等。

  第四章：siRNA與shRNA-人造基因干擾武器

科學家在解析了miRNA的作用機制后開始意識到，由于靶點眾多，miRNA的靶向性相對而言可能不夠精確，有時難以準確而有效地阻斷特定基因的表達。這種靶向性的不足，在一定程度上限制了miRNA在基因調(diào)控領(lǐng)域的應用范圍和效率。

因此科學家們發(fā)明了siRNA（小干擾RNA）這一人造的RNA干擾工具。siRNA是一種長度為21-23個核苷酸的雙鏈RNA分子。它們通常通過化學合成或體外轉(zhuǎn)錄等方法獲得，并可以與特定的靶mRNA序列完全互補配對。其作用機制與miRNA相似：當雙鏈siRNA進入細胞后，它們會被RISC復合體識別并切割成單鏈形式。然后，單鏈siRNA會與靶mRNA結(jié)合并引導RISC復合體對其進行切割或降解。與miRNA不同的是，siRNA是非內(nèi)源性的RNA分子而是人為設(shè)計合成的，我們可以對其序列、結(jié)構(gòu)和活性可以進行精確的控制和調(diào)整，因此siRNA通常比miRNA具有更強的精準性和靶向性。

siRNA一般有兩種靶向序列：一種是CDS序列（編碼序列），另一種是調(diào)控區(qū)（即非編碼區(qū)，如啟動子、增強子和轉(zhuǎn)錄因子等所在的區(qū)域）。由于CDS序列與蛋白質(zhì)的氨基酸序列直接相關(guān)，因此針對CDS設(shè)計的siRNA能夠高度特異性地識別并降解目標mRNA，從而顯著抑制靶基因的表達。而靶向調(diào)控區(qū)的siRNA設(shè)計的基因干擾過程通常涉及DNA的甲基化，因此會導致基因沉默而非降解mRNA。同時由于調(diào)控區(qū)的序列復雜性較高，且不同基因之間的調(diào)控機制存在差異，靶向調(diào)控區(qū)的siRNA可能通過影響基因表達的調(diào)控過程來間接調(diào)節(jié)基因表達水平，但其作用機制和效果可能相對復雜和難以預測。因此在我們設(shè)計siRNA時可盡量選擇CDS區(qū)來進行設(shè)計以提高其干擾效果。

然而，siRNA的發(fā)展也面臨著一些挑戰(zhàn)。由于siRNA是非內(nèi)源性的RNA分子，它們在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性和持久性相對較差。同時，siRNA的轉(zhuǎn)染效率和靶向性也受到多種因素的影響，如細胞類型、轉(zhuǎn)染方法、siRNA序列設(shè)計等。這些因素限制了siRNA在基因治療等領(lǐng)域的應用。

為了克服這些挑戰(zhàn)，科學家們在siRNA的基礎(chǔ)上發(fā)明了shRNA。shRNA是一種具有特殊結(jié)構(gòu)的RNA分子，它們可以形成一個短發(fā)夾結(jié)構(gòu)并包含兩個互補的序列，且通過載體病毒等介質(zhì)進入細胞。當shRNA進入細胞后，它們會被細胞內(nèi)的酶識別并切割成兩個單鏈形式的siRNA分子。然后，這兩個siRNA分子會分別靶向并降解不同的靶mRNA序列。

shRNA的出現(xiàn)解決了siRNA瞬時效應的問題。由于shRNA可以在細胞內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生siRNA分子，因此它們可以實現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的基因干擾效果。這種特性使得shRNA在基因治療、疾病模型構(gòu)建等領(lǐng)域具有更廣泛的應用前景。

此外，還有一個有趣的問題值得探討：能否用RNA干擾技術(shù)干擾掉RNA干擾現(xiàn)象呢？這個問題看起來似乎有些抽象和自相矛盾，但其實目前市面上售賣的許多miRNA的抑制劑可以不就可以完美解決這個問題嗎？這些抑制劑通過與miRNA結(jié)合來阻止其與靶mRNA的配對和切割過程，從而抑制RNA干擾現(xiàn)象。同樣地，我們也可以設(shè)計針對siRNA或shRNA的抑制劑來干擾它們的作用效果。這種策略為RNA干擾技術(shù)的調(diào)控和應用提供了新的思路和方法。

        第五章：三類小分子RNA的異同

在了解了RNA干擾技術(shù)的起源、發(fā)展歷程以及miRNA、siRNA和shRNA的具體作用機制后，接下來我們對這三類小分子RNA進行一個總結(jié)，分析下他們的異同。

1. 差異：

①　來源與性質(zhì)：miRNA是內(nèi)源性的RNA分子，而siRNA和shRNA則是人造的非內(nèi)源性RNA分子。

②　持久性與穩(wěn)定性：由于miRNA是內(nèi)源性的，它們在細胞內(nèi)的存在和作用更加穩(wěn)定且持久；而siRNA則存在瞬時效應的問題，需要頻繁轉(zhuǎn)染才能維持干擾效果（這也是為什么通常我們會發(fā)現(xiàn)siRNA在轉(zhuǎn)染后72-96h干擾效果非常不好的原因）；shRNA則通過持續(xù)產(chǎn)生siRNA分子來解決這一問題。

③　靶向性：siRNA和shRNA具有更強的精準性和靶向性，可以針對特定的靶mRNA序列進行干擾，一對一；而miRNA的靶點通常非常多，一個miRNA可以對應多個mRNA序列進行干擾和調(diào)節(jié)，一對多。

2. 相似之處：

①　作用效果：無論是miRNA、siRNA還是shRNA，它們都屬于基因沉默的范疇。它們都是通過特定的RNA分子與靶mRNA序列進行配對和切割來實現(xiàn)基因表達的抑制或調(diào)節(jié)。

②　原理與結(jié)構(gòu)：這三類RNA都遵循著相似的原理和結(jié)構(gòu)特點。它們都通過堿基配對來識別并切割靶RNA分子；同時，它們都具有特定的序列和結(jié)構(gòu)特征來確保其功能的實現(xiàn)。

總的來說，RNA干擾技術(shù)作為技能功能研究領(lǐng)域的一項革命性突破，為我們提供了強大的工具和方法來研究和調(diào)控基因表達。通過深入了解miRNA、siRNA和shRNA等RNA分子的作用機制和特點，我們可以更好地利用這些工具來探索生命的奧秘并為疾病治療、基因編輯等領(lǐng)域帶來新的希望和突破。本期內(nèi)容就講到這里，想看視頻版本的可以直接點擊【RNA干擾：你真的了解它的奧妙嗎？】

希望能對大家有所啟示！謝謝大家。

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