RNA免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備
來(lái)源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是RIP實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備,前面的文章我們講解了RIP(RNA Immunoprecipitation)實(shí)驗(yàn)是一種基于抗體的技術(shù),用于定位并鑒定體內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)相互作用。該技術(shù)通過(guò)捕獲特定的RNA結(jié)合蛋白(RBP)及其結(jié)合的RNA,進(jìn)而分析這些RNA的序列和功能。而普拉特澤生物——分子檢測(cè)平臺(tái)也非常重視這一點(diǎn),為廣大科研人員提RIP實(shí)驗(yàn)服務(wù)的同時(shí),還詳細(xì)介紹RIP實(shí)驗(yàn)所需的主要材料準(zhǔn)備步驟,確保大家實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行并獲取可靠的結(jié)果。
——實(shí)驗(yàn)材料
①主要試劑
㈠RIP試劑盒:推薦使用Millipore的RIP試劑盒(cat. No 17-701),該試劑盒包含了一系列用于RIP實(shí)驗(yàn)的必需試劑。
㈡PMSF:蛋白酶抑制劑,用于防止蛋白質(zhì)降解,來(lái)源Genstar(cat. No B111-01)。
㈢磷酸酶抑制劑:Selleck(cat. No B15001),用于防止磷酸酶對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本的干擾。
㈣蛋白酶抑制劑:Selleck(cat. No B14001),同樣用于防止蛋白質(zhì)降解。
㈤反轉(zhuǎn)錄試劑盒:TAKARA RR037A,用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以便進(jìn)行后續(xù)PCR分析。
㈥qPCR試劑盒:yeasen 11202ES03,用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR,以檢測(cè)特定RNA的表達(dá)水平。
——主要儀器及器材
㈠高速離心機(jī):enppendorf 5810R,用于細(xì)胞裂解和樣本處理。
㈡熒光定量qPCR儀:Thermo Fisher Scientific ViiA7,用于qPCR實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集和分析。
㈢磁力架:用于磁珠的分離和洗滌。
㈣渦旋震蕩器:用于試劑的混合和樣本的均質(zhì)化。
㈤移液器及槍頭:用于精確量取和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)樣本和試劑。
——樣本準(zhǔn)備
①細(xì)胞樣本
Ⅰ細(xì)胞培養(yǎng)與收集:選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng),如HTR-8細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時(shí),用冷PBS清洗兩次,然后用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,收集至離心管中。
Ⅱ細(xì)胞裂解:每1x10^7個(gè)細(xì)胞加入500μl的RIPA裂解液,并加入PMSF、磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑,再加入10% SDS和Triton X-100,翻轉(zhuǎn)裂解過(guò)夜后,于-20℃保存。
②組織樣本
Ⅰ組織取材與清洗:取下新鮮組織,迅速用預(yù)冷的0.9%生理鹽水漂洗,以去除殘留血液和雜質(zhì)。
Ⅱ組織處理:將組織剪切成小塊,用勻漿器或其他細(xì)胞分離設(shè)備分散為單個(gè)細(xì)胞,然后進(jìn)行離心和裂解處理,步驟與細(xì)胞樣本類似。
③磁珠準(zhǔn)備
Ⅰ重懸磁珠:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,取適量磁珠進(jìn)行重懸。
Ⅱ清洗磁珠:將重懸后的磁珠加入RIP Wash Buffer,渦旋震蕩后置于磁力架上,去除上清液,重復(fù)清洗數(shù)次。
Ⅲ抗體孵育:用RIP Wash Buffer重懸磁珠后,加入約5μg的相應(yīng)抗體,室溫孵育30分鐘。
ⅣRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀
Ⅴ配置RIP Immunoprecipitation Buffer:按照實(shí)驗(yàn)要求配置所需緩沖液。
Ⅵ孵育:將磁珠-抗體復(fù)合物與細(xì)胞裂解液混合,4℃孵育3小時(shí)至過(guò)夜。
Ⅶ清洗:孵育完成后,用RIP Wash Buffer清洗磁珠-抗體復(fù)合物,去除非特異性結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì),重復(fù)清洗數(shù)次。
④RNA純化
Ⅰ蛋白酶K處理:用Proteinase K Buffer重懸磁珠-抗體復(fù)合物,55℃孵育30分鐘,以消化結(jié)合的蛋白質(zhì)。
ⅡRNA提取:將上清液轉(zhuǎn)移至新管中,加入RIP Wash Buffer后,進(jìn)行RNA提取,包括苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步驟。
ⅢRNA溶解:用DEPC處理水溶解提取的RNA,并進(jìn)行后續(xù)分析。
——結(jié)論
RIP實(shí)驗(yàn)的材料準(zhǔn)備是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟之一。通過(guò)合理選擇試劑、儀器和樣本,并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,可以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。此外,樣本的采集、處理和保存也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素,需要特別注意。希望本文能為RIP實(shí)驗(yàn)的材料準(zhǔn)備提供有益的參考。
好,今天關(guān)于RNA免疫沉淀
實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備及結(jié)論
就說(shuō)到這里
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