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  周五好！今天普拉特澤跟大家一起來介紹一個新的實驗——酵母單雜交實驗。酵母單雜交技術(shù)是一種研究蛋白質(zhì)和特定DNA序列相互作用的技術(shù)方法，普拉特澤生物分子檢測平臺為廣大科研工作者提供酵母單雜實驗外包服務(wù)，今天就跟大家一起來看看酵母單雜交的簡單介紹！

  酵母單雜交技術(shù)最早是1993年由Li等從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，通過對報告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。由于酵母單雜交方法檢測特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件專一性相互作用的敏感性和可靠性，現(xiàn)已被廣泛用于克隆細(xì)胞中含量微弱的、用生化手段難以純化的特定轉(zhuǎn)錄因子。

  酵母單雜交的基本操作過程主要包括：

  1、設(shè)計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞。

  2、將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達(dá)的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人同一酵母中。

  3、若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達(dá)將文庫蛋白的編碼基因篩選出來。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結(jié)合蛋白。

  酵母單雜交(Yeast one-hybrid)是根據(jù)DNA結(jié)合蛋白(即轉(zhuǎn)錄因子)與DNA順式作用元件結(jié)合調(diào)控報告基因表達(dá)的原理，克隆與靶元件特異結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因(cDNA)的有效方法。其理論基礎(chǔ)是：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子由物理和功能上獨(dú)立的DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain BD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Activation domain AD)組成，因此可構(gòu)建各種基因與AD的融合表達(dá)載體，在酵母中表達(dá)為融合蛋白時，根據(jù)報道基因的表達(dá)情況，便能篩選出與靶元件有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。理論上，在單雜交檢測中，任何靶元件都可被用于篩選一種與之有特異結(jié)合區(qū)域的蛋白。

  那么酵母雙雜技術(shù)在現(xiàn)實驗中有哪些用途呢？

  1、迄今為止，應(yīng)用酵母單雜交體系已經(jīng)識別并驗證了許多與目的DNA序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時單雜交技術(shù)還被應(yīng)用于識別金屬反應(yīng)結(jié)合因子。正向與反向單雜交體系的結(jié)合，還可用于篩選阻礙DNA與蛋白質(zhì)相互作用的突變的單個核苷酸。

  2、目前，在研究DNA—蛋白質(zhì)相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：①確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用;②分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點(diǎn)蛋白的新基因;③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

  3、酵母單雜交是在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的技術(shù)，酵母單雜交主要用于研究蛋白質(zhì)和DNA的相互作用，而酵母雙雜交主要是用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用。

  在實際的應(yīng)用中，酵母雙雜也有一些無法避免的缺點(diǎn)，如：

  由于插入的靶元件與酵母內(nèi)源轉(zhuǎn)錄激活因子可能發(fā)生相互作用，或插入的靶元件不需要轉(zhuǎn)錄激活因子就可以激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，因此往往產(chǎn)生假陽性結(jié)果。如果酵母表達(dá)的AD融合蛋白對細(xì)胞有毒性，或融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)不能穩(wěn)定地表達(dá)，或融合蛋白發(fā)生錯誤折疊，或者不能定位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，以及融合的Gal4AD封閉了蛋白質(zhì)上與DNA相互作用的位點(diǎn)，則都可能干擾AD融合蛋白結(jié)合于靶元件的能力，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

  酵母單雜技術(shù)的簡單介紹我們就講到這里啦，關(guān)于酵母雙雜的見解、原理、流程、應(yīng)用、缺點(diǎn)你都記住了嗎？沒記住沒關(guān)系，我們幫您做，如果有酵母單雜實驗外包或代做的需求，請選擇為真實實驗而生的普拉特澤~