雙熒光素酶檢測實驗步驟【超詳細(xì)版】
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
普拉特澤生物為廣大生命科學(xué)研究人員提供雙熒光素酶檢測外包服務(wù),上次跟大家一起學(xué)習(xí)了雙熒光素酶的測定方法,讓我們學(xué)習(xí)到了雙熒光素酶檢測實驗是一種廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中的方法,可以用于研究基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)交互等多個方面。本文將詳細(xì)介紹雙熒光素酶檢測實驗的步驟和注意事項。
一、實驗前準(zhǔn)備
1.1. 構(gòu)建表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒
實驗前需要構(gòu)建表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒,質(zhì)粒中需要包含目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域和雙熒光素酶基因。常用的雙熒光素酶有熒光素酶A(Luciferase A)和熒光素酶B(Luciferase B),可以選擇適合實驗的熒光素酶。在選擇啟動子區(qū)域時,需要考慮該啟動子區(qū)域是否與目標(biāo)基 因表達(dá)相關(guān),并且需要避免啟動子區(qū)域過長或者包含重復(fù)序列等因素導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定。質(zhì)粒的構(gòu)建可以通過基因克隆等方法完成。
1.2. 篩選細(xì)胞系
選擇適合的細(xì)胞系也是進(jìn)行雙熒光素酶檢測實驗前的重要準(zhǔn)備工作。需要選擇細(xì)胞系的生長速度適中,易于培養(yǎng),能夠表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞系。常用的細(xì)胞系包括HEK293、CHO、HeLa等。對于不同的實驗?zāi)康?,也可以選擇不同的細(xì)胞系。
1.3. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
質(zhì)粒需要通過轉(zhuǎn)染的方式引入細(xì)胞中,常用的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等。在轉(zhuǎn)染前需要準(zhǔn)備好質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑,以及處理好的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染的過程需要注意轉(zhuǎn)染試劑的濃度和轉(zhuǎn)染時間,以避免對細(xì)胞造成不必要的損傷。
雙熒光素酶檢測結(jié)果
二、實驗步驟
以下是雙熒光素酶檢測實驗的一般步驟:
1.構(gòu)建表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒:在質(zhì)粒中克隆想要研究的基因的啟動子區(qū)域(或者其他感興趣的區(qū)域),并將雙熒光素酶基因放在該啟動子區(qū)域下游,形成表達(dá)雙熒光素酶的質(zhì)粒。
2.細(xì)胞培養(yǎng):將要檢測的細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使其生長至合適的密度。
3.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒:將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細(xì)胞中,使其表達(dá)雙熒光素酶。
4.樣本處理:根據(jù)實驗的需要,處理細(xì)胞樣本,如添加藥物、激素等。
5.添加底物:將Luciferin底物加入到樣本中,Luciferin是一種可以被熒光素酶催化分解的化合物,分解后會放出熒光。
6.測定熒光:使用熒光儀測定Luciferin分解后放出的熒光強度,該熒光強度反映了雙熒光素酶的活性。同時,也可以在熒光素酶的另一端接入Renilla熒光素酶,用來進(jìn)行內(nèi)部對照,來排除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的影響。
7.停止反應(yīng):在熒光測定后,停止Luciferin分解的反應(yīng),一般是通過加入一個強堿(如SDS)的方式。
8.測定內(nèi)部對照:使用熒光儀測定Renilla熒光素酶的熒光強度,作為內(nèi)部對照,用來排除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的影響。
9.計算結(jié)果:根據(jù)實驗的需要,計算樣本中Luciferin分解的熒光強度,比較各樣本之間的差異,來推斷基因表達(dá)水平或信號通路活性等。
雙熒光素酶檢測結(jié)果統(tǒng)計圖
需要注意的是,每個實驗具體步驟可能有所不同,具體實驗條件需要根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整。同時,實驗過程中需要注意避免細(xì)胞毒性和質(zhì)粒毒性等因素對實驗結(jié)果的影響。
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