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        細(xì)胞凍存與復(fù)蘇問(wèn)題答疑由普拉特澤生物——細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)給大家總結(jié)分享。普拉特澤生物暑期跟大家一起堅(jiān)守實(shí)驗(yàn)崗，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)不但承接各類(lèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與檢測(cè)，更有上千株可售細(xì)胞株在細(xì)胞庫(kù)內(nèi)冷凍保存。大家購(gòu)買(mǎi)細(xì)胞后總喜歡詢問(wèn)細(xì)胞凍存與復(fù)蘇相關(guān)問(wèn)題，今天小編就把它全部整理下來(lái)供大家參考學(xué)習(xí)！

        問(wèn)題一：細(xì)胞凍存為什么要添加保護(hù)劑?

        細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)，細(xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下冷凍，細(xì)胞內(nèi)外的水分會(huì)很快形成水晶從而引發(fā)一系列的不良反應(yīng)：首先，部分蛋白質(zhì)因局部電解質(zhì)濃度增高和pH值改變而變性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

        其次，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和細(xì)胞膜系統(tǒng)上蛋白質(zhì)，酶的變性等會(huì)限礙細(xì)胞的能量代謝。再次，胞膜上的類(lèi)脂蛋白復(fù)合體在冷凍中易發(fā)生破壞引起胞膜通透性的改變，使細(xì)胞內(nèi)容物喪失。

        最后，隨著冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成DNA的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷從而引起細(xì)胞死亡。

        添加冷凍保護(hù)劑可以很好的改善細(xì)胞的破壞與死亡情況。

        問(wèn)題二：冷凍管應(yīng)如何解凍?

        從液氮押中取出細(xì)胞置-80℃冰箱中數(shù)分鐘，讓管中液氮控發(fā)后，再放入37℃的水

        浴鍋中(預(yù)防凍存管爆裂)，輕搖凍存管使其最好在2 min內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過(guò)凍存管管口，否則容易造成污染。

        問(wèn)題三：高效進(jìn)行細(xì)胞凍存應(yīng)該注意什么?

        1、緩慢冷凍：慢凍可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞不會(huì)因產(chǎn)生大的冰晶而受到損害。相反，細(xì)胞內(nèi)若出現(xiàn)大結(jié)晶會(huì)引起細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。

        2、細(xì)胞活力及濃度：細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好、致密度約為80-90%活力達(dá)90%以上的狀態(tài)下凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時(shí)期凍存。

        3、凍存密度：凍存時(shí)細(xì)胞密度少于5x105個(gè)活細(xì)胞/mL時(shí)，很難成功復(fù)蘇。

        4、凍存管蓋子：凍存管的蓋子一定要擰緊，否則水浴復(fù)蘇時(shí)水會(huì)滲入造成污 染。

        5、凍存時(shí)間：細(xì)胞不可長(zhǎng)期保存在-80℃冰箱中。我們建議在-80℃冰箱中的保存時(shí)間不要超過(guò)48h。

        問(wèn)題四：細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的最佳時(shí)間是什么時(shí)候?

        細(xì)胞在體外生長(zhǎng)期間，通常分為三個(gè)階段:潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。潛伏期通常是細(xì)胞剛剛傳代，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始貼附基質(zhì)和伸展骨架，代謝活動(dòng)集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達(dá)，細(xì)胞量在這段時(shí)間內(nèi)幾乎沒(méi)有增加。

        隨后，細(xì)胞開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)期，核酸轉(zhuǎn)錄翻譯旺盛，DNA解旋、配對(duì)頻繁，胞內(nèi)物質(zhì)傳遞迅速，細(xì)胞數(shù)量迅速增長(zhǎng)。如果在這個(gè)時(shí)期凍存，實(shí)際上是強(qiáng)行將細(xì)胞凍結(jié)在代謝的某一時(shí)刻，勢(shì)必造成對(duì)解旋的DNA、轉(zhuǎn)錄翻譯中的RNA和蛋白的機(jī)械損傷，增加某個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)。

        有著細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)，培養(yǎng)容器內(nèi)，細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上。大部分細(xì)胞因?yàn)椤敖佑|抑制”而停止高速代謝和增殖，胞內(nèi)活動(dòng)趨于平緩。所以，我們建議在剛剛進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)凍存細(xì)胞，既可以獲得足量的細(xì)胞，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成過(guò)多的機(jī)械損傷。

        問(wèn)題五：臨床手術(shù)切下來(lái)的腫瘤組織的凍存和復(fù)蘇應(yīng)該怎么做?

        不論是腫瘤組織、正常組織或細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇需要把握的關(guān)鍵都是“慢凍快融”。

        組織凍存中使用的“玻璃化液”和細(xì)胞凍存中使用的“凍存液”作用的本質(zhì)都是結(jié)合或吸收細(xì)胞內(nèi)的自由水，避免或減少細(xì)胞在冷凍過(guò)程中，胞內(nèi)的自由水凝結(jié)為冰晶刺破細(xì)胞。

        通常，環(huán)境溫度在-5~-10℃之間時(shí)，細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始形成冰晶。快速的冷凍會(huì)加劇冰晶的形成，所以，我們?cè)趦龃婕?xì)胞時(shí)會(huì)使用程序降溫儀，含異內(nèi)醇的程序降溫盒或者特質(zhì)的泡沫盒。這些儀器、設(shè)備、試劑的使用都是為了減緩細(xì)胞冷凍速度。

        至于復(fù)蘇，我們一般是在37℃水浴鍋中震蕩，讓細(xì)胞、組織迅速度過(guò)“冰晶危險(xiǎn)期”。

        問(wèn)題五：細(xì)胞在液氮中可以保存多久?

        細(xì)胞凍存可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，細(xì)胞儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。

        為妥善起見(jiàn)，特別是很多未被凍存過(guò)的細(xì)胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇1次，觀察細(xì)胞對(duì)凍存的適應(yīng)性。已建系的細(xì)胞最好也每年復(fù)蘇1次后，再繼續(xù)凍存。

        好啦，那大家常提的問(wèn)題咱們就總結(jié)到這里啦，如果您還有其他的問(wèn)題也可以給我們留言提出，小編會(huì)收錄到文章中跟大家一起學(xué)習(xí)進(jìn)步的哦。當(dāng)然有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需要代做或細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)的話一定要選擇我們的普拉特澤生物——細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)！