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        今天普拉特澤生物跟大家一起學(xué)習(xí)的是細(xì)胞衰老的檢測(cè)方法。細(xì)胞衰老時(shí)，細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)呈退行性變化，根據(jù)其特征，我們常用于檢測(cè)衰老的方法主要是β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)和端粒長(zhǎng)度的檢查兩個(gè)，我們來(lái)一個(gè)一個(gè)看：

一、β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

 1995年，Dimiri等發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)二倍體成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)基pH值為6時(shí)，其β-半乳糖苷酶染色的陽(yáng)性率隨代齡增加而逐漸上調(diào)，他們把這種中性β-半到糖苷酶定義為SAβ-gal，即衰老相關(guān)的β-半到糖荷酶，衰老細(xì)胞或組織產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal，生成深藍(lán)色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到。在人體表皮角質(zhì)層細(xì)胞中，也可以發(fā)現(xiàn)SA-β-gal隨年齡的增加而增加。并目，SA-β-gal不依賴(lài)干DNA復(fù)制，可以區(qū)分衰老細(xì)胞與靜止期的細(xì)胞。

 SA-β-gal是一種體內(nèi)體外都適用的檢測(cè)衰老的生物標(biāo)記物。由于檢測(cè)SA-β-gal的方法簡(jiǎn)單易行，其在檢測(cè)衰老細(xì)胞方面有很廣泛的應(yīng)用。

 二、端粒長(zhǎng)度的檢查

 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端頂部的核蛋白結(jié)構(gòu)，由高度保守的TTAGGG 重復(fù)序列組成，其存在可以保護(hù)染色體末端，是維持染色體穩(wěn)定的重要因素。鑒于端粒的特殊結(jié)構(gòu)，端粒的長(zhǎng)度會(huì)隨著每次細(xì)胞的分裂而縮短，因此，端粒長(zhǎng)度是衰老的一個(gè)重要生物標(biāo)志。這里我們主要討論端粒限制性片段(TRF)分析及熒光原位雜交(FISH)法。

首先是端粒限制性片段分析：TRF分析也稱(chēng)作端粒的Southern印跡法，是應(yīng)用針對(duì)端粒重復(fù)序列的探針來(lái)檢測(cè)限制性酶切后所保留的端粒的方法。限制性酶會(huì)將基因組DNA消化為短的片段，留下大量完好的端粒，即所謂的端粒限制性片段。以凝膠電泳分離基因組片段，通過(guò)放射性探針(CCCTAA)。雜交“TTAGGG”重復(fù)序列的方式可以檢測(cè)到端粒的存在。鑒于細(xì)胞的異質(zhì)性，TRFs的大小不一，反映出細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度的不同。TRF分析對(duì)試劑和儀帶無(wú)特殊要求，因此這種方法目前有看較為廣泛的應(yīng)用，但它存在一些缺陷，TRE分析測(cè)量的是整個(gè)樣品端粒長(zhǎng)度的平均值，由于不同端粒的長(zhǎng)度相差很大，這種方法既不能分辨單個(gè)端粒也不能分辨單個(gè)細(xì)胞內(nèi)端粒的平均長(zhǎng)度。鑒于短端粒在電泳遷移中不集中且雜交信號(hào)弱，這種方法很難檢測(cè)到在衰老研究中尤為重要的短端粒。另外，這種方法還存在操作復(fù)雜，所需樣品量大等缺陷，相比之下，FISH技術(shù)樣品用量小直觀、敏感，可以檢測(cè)染色體問(wèn)端粒長(zhǎng)度的變化。

 熒光原位雜交：FISH端粒長(zhǎng)度分析基于熒光肽核酸探針(PNA)的特導(dǎo)性標(biāo)記。PNA探針是DNA同源的合成肽鏈，其中DNA帶負(fù)電的磷酸戊糖骨架被不帶由的N-2胺乙基甘氨酸骨架所取代，這樣的修飾產(chǎn)生了非常穩(wěn)定高效的針對(duì)靶DNA 的特異性雜交。PNA探針發(fā)出的熒光信號(hào)與所雜交的端粒長(zhǎng)度直接相關(guān)，因此這種方法可用于測(cè)量端粒的長(zhǎng)度，FISH不但可以應(yīng)用于單細(xì)胞水平的單個(gè)染色體端粒長(zhǎng)度的測(cè)量，還可應(yīng)用于組織勻漿及組織切片。

 OK！那關(guān)于細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的方法我們就學(xué)習(xí)到這里啦，如果您也有自己的想法或者需要細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)外包的需求歡迎隨時(shí)給我們留言！