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        熒光定量PCR實驗操作步驟由普拉特澤生物跟大家一起學習進步，熒光定量PCR技術作為表達檢測平臺重要的實驗手段，以成熟的技術手段專業(yè)承接熒光定量PCR代做服務，同時更積累了大量的實操經驗，今天咱們就來跟大家一起一步一步來看，熒光定量PCR的操作步驟是怎樣的！

        熒光定量PCR的操作步驟可以簡單概括為：RNA 提取 → 反轉錄 → 設計引物 → Q-PCR，咱們一步一步看。

        熒光定量PCR第一步：RNA提取

        1、首先進行不同樣本的預處理：

        （1）組織樣本：迅速將新鮮的組織切成合適的大小，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol。

        （2）全血樣品：加入3-5倍體積的紅細胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min，室溫3500rpm離心6min。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol。

        （3）細胞樣品：懸浮液中生長的細胞，通過離心收集細胞后，每1×105?106細胞加入1mL Trizol，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲存一個月。貼壁生長的細胞，可以移除培養(yǎng)基后，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細胞。

        2、直接法提取RNA

        （1）加入1ml Trizol試劑，混勻，冰上孵育10min。

        （2）4℃，12000rpm離心10min，小心轉移上清液到不含顆粒的新EP管中。

        （3）加入200ul氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育5min。

        （4）4℃，12000rpm離心15min?；旌弦悍秩龑樱ㄗ钕旅娴谋椒?- 氯仿有機相，中間相和上層水相。小心轉移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相，可留下少量上層液體?。?/span>Note：質量比數(shù)量更重要！）

        （5）加入等體積的異丙醇，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min。

        （6）4℃，12000rpm離心10min。棄上清，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

        （7）4℃，12000rpm離心5min，棄上清，室溫下風干5-10min（不要太干，過度干燥會導致RNA難溶解?。?。將RNA溶于15μl-50μlDEPC水中。

        （8）立即進行反轉錄反應，或先-80℃長期保存。

        熒光定量PCR第二步：反轉錄

        1、RNA純度和完整度鑒定

        紫外分光光度法測定RNA濃度和純度：在pH8.0的TE緩沖液中稀釋RNA，并在260nm和280nm下測量吸光度，一般Abs 260nm：280nm比率應該是1.7-2.1，說明RNA的純度較好。

        RNA條帶完整度測定：評估RNA的完整性，取部分樣本做瓊脂糖凝膠電泳。完整的RNA條帶包括28S，18S和5S核糖體RNA。通常，28S / 18S> 2意味著RNA具有較高的完整度。

        2、反轉錄：PCR條件：42℃孵育40min，85℃加熱5min，4℃保存。將第一鏈cDNA儲存在-20℃。

        熒光定量PCR第三步：引物設計

        引物設計標準

        （1）PCR擴增子長度：50-180bp；

        （2）引物長度17-25bp；

        （3）GC含量：45-55％；

        （4）Tm：58?68℃，引物對間差異不大于2℃；

        （5）堿基要隨機分布，盡量均勻。3′端要避開AT，GC rich的區(qū)域，避開T/C或A/G連續(xù)結構（2-3個）。引物自身和引物間不能存在互補。引物3’末端為G或C；

        （6）避免DNA污染，跨外顯子接頭區(qū)；

        （7）至少設計2-3對引物，預實驗篩選最佳引物；

        （8）將所有設計的引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對以確定它們對靶基因特異性。

        熒光定量PCR第四步：Q-PCR反應

        注意： 一般使用cDNA模板的10倍稀釋液加入反應體系，因為過高濃度的反轉錄體系殘留如逆轉錄酶和相關緩沖液組分會抑制DNA聚合酶活性，從而降低擴增效率。

        1、擴增循環(huán)。

        2、溶解程序：擴增循環(huán)結束后，降溫至60℃，然后加熱升溫至95℃變性DNA產物。

        變性：高溫孵育將dsDNA變成成單鏈，并松弛ssDNA中的二級結構。 通常DNA聚合酶可承受的最高溫度為95℃。如果模板GC含量高，可適當延長變性時間。

        退火：退火期間，互補序列結合，一般使用低于引物的Tm 5℃作最適退火溫度。

        延伸：70-72℃，DNA聚合酶活性最佳，并且以每秒100個堿基的速率延伸。當qPCR中的產物長度較小時，此步驟可與退火在60℃同步進行。

        最后進行熒光定量PCR實驗的數(shù)據(jù)分析，那實驗步驟我們就講解到這里啦，下期咱們講講，最后一步的數(shù)據(jù)分析應該如何分析，如何看熒光定量PCR的結果，如多您也想學習更多關于熒光定量PCR的實驗和結果分析或有熒光定量PCR代做外包的需求歡迎給普拉特澤留言，技術會第一時間聯(lián)系到您的哦~