組織樣本EdU檢測(cè)難點(diǎn)突破：固定液選擇與通透處理全方案優(yōu)化
2025-06-27 16:30:37
來(lái)源/作者：普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺(tái)
固定液選擇與通透處理全方案優(yōu)化由普拉特澤生物給大家解答與分享，普拉特澤生物細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)可承接各種細(xì)胞檢測(cè)外包服務(wù)，包括檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲等實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)，本文是我們?cè)诔薪訑?shù)百例EdU檢測(cè)中，對(duì)操作過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題與大家留言咨詢最多的問(wèn)題進(jìn)行回答與建議，快來(lái)收藏吧！
組織樣本的特殊性常導(dǎo)致信號(hào)弱、背景高、形態(tài)破壞三大痛點(diǎn)。普拉特澤生物針對(duì)固定液選擇與通透處理兩大核心難點(diǎn)，提供經(jīng)實(shí)戰(zhàn)驗(yàn)證的解決方案
——組織EdU檢測(cè)的三大核心挑戰(zhàn)
固定與通透的平衡困境
→過(guò)度固定：醛類固定劑過(guò)度交聯(lián)導(dǎo)致抗原遮蔽，阻礙EdU點(diǎn)擊反應(yīng)
→通透不足：組織致密結(jié)構(gòu)阻礙試劑滲透，深部細(xì)胞標(biāo)記失敗
→核酸移位風(fēng)險(xiǎn)：酸性/醇類固定液引起DNA遷移，定位失真
組織自發(fā)熒光干擾
尤其常見(jiàn)于：
富含彈性蛋白的組織（血管、肺）
含脂褐素的衰老組織（腦、肝）
多重標(biāo)記兼容性差
需同時(shí)滿足：
EdU點(diǎn)擊化學(xué)效率
目標(biāo)抗原表位保存
細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性
——固定液選擇：科學(xué)匹配組織類型
█ 醛類固定劑：首選4% PFA的精準(zhǔn)控制
適用組織：大多數(shù)軟組織（腦、肝、腎、腫瘤）
優(yōu)化方案：
- 濃度：4% PFA（pH 7.4）
- 時(shí)間：室溫2-4小時(shí)（或4℃過(guò)夜）
- 關(guān)鍵：灌注固定 > 浸泡固定（尤其對(duì)腦組織）
禁忌：
避免使用含乙酸的固定液（如Bouin's液）—— 引起DNA片段化
█ 醇類固定劑：特殊場(chǎng)景的替代方案
適用場(chǎng)景：
需要保留磷酸化表位（如p-Histone H3）
脂肪組織（減少脂質(zhì)流失）
推薦配方：
- 冰乙醇:冰醋酸 = 3:1（v/v）
- 4℃固定1-2小時(shí)
缺陷：可能導(dǎo)致組織收縮
█ 復(fù)合固定劑：平衡形態(tài)與抗原保存
推薦配方：
- 4% PFA + 0.5% 戊二醛（增強(qiáng)硬度）
- 適用：骨組織、軟骨
- 警告：戊二醛>1%將淬滅熒光！
——通透處理：突破組織屏障的關(guān)鍵
目標(biāo)：打開(kāi)生物膜屏障，允許>500Da分子通過(guò)
█ 通透劑選擇矩陣
進(jìn)階通透策略
梯度通透法（針對(duì)厚組織切片）
減少邊緣過(guò)度通透導(dǎo)致的組織脫落
酶輔助通透
推薦：
膠原蛋白酶IV（1mg/ml，37℃×15min）→ 纖維化組織
透明質(zhì)酸酶（2U/μl，37℃×30min）→ 富含胞外基質(zhì)組織
——實(shí)戰(zhàn)工作流：組織EdU檢測(cè)七步法
▲活體標(biāo)記：EdU腹腔注射（5mg/kg）
▲灌注固定：4% PFA心內(nèi)灌注（優(yōu)于浸泡固定3倍！）
組織處理：
▲脫水：30%蔗糖溶液沉底（防冰晶）
▲包埋：OCT > 石蠟（避免高溫抗原破壞）
▲切片通透：0.5% Triton + 0.1% 皂苷混合液×45min
Click反應(yīng)：
- 試劑：Click-iT? Plus EdU Kit（貨號(hào)：C10637）
- 染料：AF647（避免自發(fā)熒光干擾）
- 時(shí)間：避光30min（延長(zhǎng)至60min穿透>50μm切片）
抗體染色：抗目標(biāo)抗原抗體（如Ki-67、GFAP）
自發(fā)熒光阻斷：
0.1% 剛果紅（淬滅脂褐素）
0.3M 甘氨酸（減少醛基熒光）
——組織特異性優(yōu)化方案
——故障排除：拯救失敗實(shí)驗(yàn)
——三維組織EdU成像
透明化技術(shù)聯(lián)用
流程：
優(yōu)勢(shì)：實(shí)現(xiàn)全器官增殖細(xì)胞定位
多重免疫-EdU標(biāo)記
案例：
EdU-AF647（增殖細(xì)胞）
CD31-AF555（血管）
α-SMA-AF488（成纖維細(xì)胞）
關(guān)鍵：采用酪酰胺信號(hào)放大（TSA）提升弱抗原信號(hào)
——最后的最后
組織EdU檢測(cè)的成功取決于：
精準(zhǔn)匹配的固定方案 + 階梯式通透策略 + 組織特異性優(yōu)化。
遵循“溫和固定、梯度通透、紅外染料避讓自發(fā)熒光”三大原則，可突破90%以上的技術(shù)瓶頸。
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