核質(zhì)分離檢測(cè)不同組分的基因表達(dá)
考馬斯亮藍(lán)有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍(lán)G250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來(lái)作為蛋白質(zhì)含量的測(cè)定?？捡R斯亮藍(lán)R250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來(lái)對(duì)病理組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行染色。通過(guò)PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核質(zhì)分離試劑盒將細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)分開，提取這兩部分的RNA，進(jìn)行QP檢測(cè)。檢測(cè)胞質(zhì)與胞核中目的基因及內(nèi)參基因的表達(dá)在細(xì)胞總表達(dá)的占比。
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實(shí)驗(yàn)介紹
實(shí)驗(yàn)原理
通過(guò)PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核質(zhì)分離試劑盒將細(xì)胞的胞核與胞質(zhì)分開，提取這兩部分的RNA，進(jìn)行QP檢測(cè)。檢測(cè)胞質(zhì)與胞核中目的基因及內(nèi)參基因的表達(dá)在細(xì)胞總表達(dá)的占比。
實(shí)驗(yàn)方法
Step1: 細(xì)胞收集之后，預(yù)冷的PBS清洗一遍，3000g離心5min后取上清，置于冰上。加入合適體積預(yù)冷的Cell Fractionation Bufeer 重懸細(xì)胞，輕輕打勻。冰上孵育10min。
Step2: 孵育10分鐘后，500g，4℃離心5min，分離胞漿和胞核。上清轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的EP管中，置于冰上，此為胞漿。
Step3: 胞核沉淀加入預(yù)冷的Cell Fractionation Bufeer 重懸，吹打混勻后500g，4℃離心1min，去上清。胞核沉淀中加入預(yù)冷的Cell Disruption Buffer ,冰上裂解至溶液均一。(裂解至溶液透明）
Step4: 胞漿和胞核中分別加入等體積的2X Lysis/Binding Solution，上下顛倒混勻，室溫裂解。
Step5: 加入與裂解液相同體積的無(wú)水乙醇，混合均勻。
Step6: 將混合液分別置于濾柱中過(guò)濾，10000g，室溫離心1min,丟棄EP管，轉(zhuǎn)移濾柱至試劑盒提供的EP管中進(jìn)行清洗。
Step7: 加入700ulWash SolutionⅠ10000g，室溫離心1min。倒掉液體，濾柱中加入500ulWash Solution2/3，10000g，室溫離心,10000g,室溫離心1min
Step8：倒掉廢液，空管離心一次，10000g，室溫離心1min,更換EP管。
Step9：DEPC水加熱到95-100℃加35ul至濾柱中央，10000g室溫離心30s。丟棄濾柱，分別得到胞漿和胞核的RNA。
案例展示
左：擴(kuò)增曲線； 右：溶解曲線
通過(guò)監(jiān)測(cè)不同循環(huán)階段的熒光強(qiáng)度，直至曲線平滑達(dá)到細(xì)胞中該基因的表達(dá)高峰。Ct值越低，表達(dá)越高。
通過(guò)2-meanCt公式計(jì)算基因在胞核與胞質(zhì)的表達(dá)大小，繪制柱狀圖，得到基因在胞核與胞質(zhì)中的表達(dá)占比。
技術(shù)總結(jié)
注意事項(xiàng)：
1. 2X Lysis/Binding Solution可能在4°C下凝固。使用前，將溶液加熱至37°C，偶爾攪拌5-10分鐘，或直至完全溶解。
2. 洗脫水需要在95-100℃水浴鍋中預(yù)熱，更好的洗脫柱膜上的RNA，不過(guò)由于洗脫溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致RNA有些許降解。
交付標(biāo)準(zhǔn)
1. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告
2. 真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3. 原始圖片
4. 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)
5. 剩余物料在周期內(nèi)可返還（超過(guò)周期，不予返還）
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
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