酵母雙雜交
酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別克隆（融合）到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4等）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。
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實(shí)驗(yàn)介紹
【技術(shù)原理】
隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展，為適應(yīng)對眾多基因或蛋白進(jìn)行功能研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)在基因功能的研究中得到廣泛的應(yīng)用。
酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合功能域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)基因的上游，后者同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。將編碼DNA結(jié)合功能域的基因與已知誘餌蛋白質(zhì)基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白，將編碼DNA轉(zhuǎn)錄激活域的基因和cDNA文庫的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上，同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母。當(dāng)兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因，從而通過功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽性菌落。將陽性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對載體中插入的文庫基因進(jìn)行測序和分析工作。
酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)原理圖
【實(shí)驗(yàn)流程】
案例展示
酵母雙雜交系統(tǒng)（two-hybrid system）案例一
酵母雙雜交系統(tǒng)（two-hybrid system）案例二
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運(yùn)輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 動物組織 | 單個(gè)樣品>0.1g，2mlEP管或凍存管裝，不要過量；樣本應(yīng)盡量新鮮，如不能立即提取蛋白或核酸，應(yīng)液氮速凍后凍存于-80℃或更低，凍存樣本避免反復(fù)凍融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 種子樣本 | 去殼新鮮或保存于液氮中的的種子樣本，單個(gè)樣品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 貼壁/懸浮細(xì)胞 | 1. 總RNA或蛋白：106cell/指標(biāo)、漿/核RNA或蛋白：107cell/指標(biāo)、線粒體RNA或蛋白：2*107 cell/指標(biāo)，樣本盡量新鮮，細(xì)胞收取后直接加Trizol（QPCR檢測）或直接凍存于-80℃ 2. 若細(xì)胞處理（加藥、轉(zhuǎn)染、感染）后狀態(tài)差應(yīng)酌情加大收樣量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清樣品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白細(xì)胞勻漿>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蠟包埋樣品 | 由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋的石蠟塊，有效厚度大于 0.1cm； 新鮮的 FFPE 組織切片，每片厚度不超過 10μm，2~8 張，表面積不超過 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗體 | 1. 按樣本種屬提供滿足相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求的抗體； 2. 按抗體說明書要求寄送，盡量避免分裝；如分裝，確保量足夠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并提供抗體說明書。 3.保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，抗體的量應(yīng)大于實(shí)驗(yàn)所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)基因至少提供兩對引物， 附帶公司引物合成單。 | -20℃ | 冰袋或常溫 |
電話：400-691-6686
在線時(shí)間：8:00-24:00
微信關(guān)注公眾號
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