原位雜交
原位雜交（in situ hybridization）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記的核酸探針與組織、細胞等樣本中待測目的基因按堿基配對原則進行特異性結(jié)合而形成的雜交體，然后再用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測方法。
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【技術(shù)原理】
原位雜交（in situ hybridization）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記的核酸探針與組織、細胞等樣本中待測目的基因按堿基配對原則進行特異性結(jié)合而形成的雜交體，然后再用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測方法，在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，從而在顯微鏡下進行目的基因的定位檢測觀察。主要檢測方法分為DAB顯色和熒光顯色兩種。
【實驗流程】
案例展示
組織的miRNA原位雜交
技術(shù)總結(jié)
【常見問題】
1、RNA探針長度以50-150bp為佳，探針已進入細胞，雜交率高，雜交時間短。
2、原位雜交反應(yīng)中探針濃度應(yīng)超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為背景著色度高低與探針濃度有關(guān)。
3、雜交溫度應(yīng)低于解鏈或溶解溫度20-30℃。雜交反應(yīng)的時間可隨探針濃度的增加而縮短，雜交時間過短會造成雜交不完全，雜交時間過長會增加非特異性著色。
4、組織固定或蔗糖脫水不好會使組織有較多的空泡。
【注意事項】
1、固定液的選擇及固定時間
石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林（含1/1000 DEPC）固定1～24h，其它固定液對實驗結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。
2、組織切片和載玻片的選擇
組織切片4～5μm 厚，過厚或過薄的切片均會對信號的強弱產(chǎn)生影響，而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會在預(yù)處理時掉片。載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的可使用更好的陽離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。
3、實驗過程中切片的預(yù)處理
切片預(yù)處理過程包括煮沸處理和蛋白酶消化。當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過厚或烤片不足時，在煮沸過程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過夜。煮沸過程中要嚴(yán)格控制實驗溫度和時間。
送檢與交付標(biāo)準(zhǔn)
| 樣品類型 | 樣品需求 | 保存條件 | 運輸條件 | 備注 |
|---|---|---|---|---|
| 新鮮組織 | 新鮮取材組織，用 PBS 清洗干凈血液等，立即-80℃保存 | -80℃ | 干冰 | 所有樣本均須有唯一標(biāo)記，且標(biāo)記清晰可識 |
| 一般固定組織 | 一般組織體積不超過2cmX2cmX0.5cm，固定時盡量保持組織的原有形態(tài)并清理干凈血液及多余部分，如腸道內(nèi)容物；固定液體積為組織大小的10倍以上，容器足夠容納組織不使其擠壓變形。標(biāo)注好固定液類型和固定時長 | 常溫 | 常溫 | |
| 特殊固定組織 | 睪丸、眼球、脊髓、肌肉等組織：推薦使用對應(yīng)的特殊固定液進行固定，以保證固定效果。如Bouin液，適用于睪丸組織、皮膚組織及眼球的固定 | |||
| 組織蠟塊 | 組織由標(biāo)準(zhǔn)的石蠟包埋盒包埋（尺寸為30*24*7mm），石蠟與組織要均勻接合，不能有裂痕；蠟塊厚度根據(jù)所需切片的數(shù)量而定，有效厚度至少要超過 0.1cm。盡量提供半年內(nèi)的組織蠟塊，超過半年的蠟塊抗原可能丟失，做免疫組化可能出現(xiàn)檢測不到蛋白。 | 常溫 | 常溫 | |
| 組織切片 | 需用防脫載玻片進行撈片，并注明切片厚度、已烤片溫度與時間，組織應(yīng)在靠近切片下端 1/3 處。 | 4℃ | 冰袋 | |
| 細胞爬片 | 使用 12 孔板或 24 孔板專用細胞爬片，細胞爬片經(jīng)固定后用 PBS 洗滌 2~3 次，保存在 PBS 中，用封口膜密封孔板。每個爬片在孔板蓋上應(yīng)有唯一的標(biāo)記，并有電子版的分組信息，以防標(biāo)記在運輸途中模糊。 | 常溫 | 常溫 | |
| 植物樣本 | 新鮮組織FAA固定，木質(zhì)化程度不高；對于較薄的葉片，如果要求平行葉片切片，難以保證切完整；根莖要求直徑>1mm | 常溫 | 常溫 | |
| 抗體 | 保存抗體的抗體管上應(yīng)有能夠識別此抗體的標(biāo)記，并附帶說明書，抗體的量應(yīng)大于實驗所需的量。組織切片、組織芯片按稀釋后 100μl 一張切片計算抗體用量， 24 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 200μl 一張計算抗體用量，12 孔板細胞爬片圓形蓋玻片按稀釋后 400μl 一張計算抗體用量。 | -20℃ | 冰袋或干冰 |
電話：400-691-6686
在線時間：8:00-24:00
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