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這篇發(fā)表于Nat Commun（ IF:11.8780）雜志上的文章將WB實(shí)驗(yàn)從頭貫徹到尾，研究黑色素瘤細(xì)胞中ITCH/BRAF/MEK/ERK通路。

本文結(jié)論：在黑色素瘤細(xì)胞中，受到細(xì)胞因子的刺激，BRAF主要通過K27位點(diǎn)被多聚泛素化，且不導(dǎo)致最終的蛋白降解。這種非典型的泛素化作用是由ITCH E3連接酶響應(yīng)c-Jun-N-末端激酶（JNK）介導(dǎo)的磷酸化作用而催化的。K27位點(diǎn)的BRAF泛素化消除了14–3–3介導(dǎo)的BRAF激酶活性抑制，導(dǎo)致BRAF / MEK / ERK信號(hào)得以維持，進(jìn)而有助于腫瘤細(xì)胞因子促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的存活。

Fig 1. ITCH通過K27位點(diǎn)使BRAF泛素化

黑色素瘤細(xì)胞中，內(nèi)源性BRAF的多泛素化。為了確定BRAF蛋白上的多聚泛素化位點(diǎn)，作者構(gòu)建了BRAF單泛素化位點(diǎn)突變體，結(jié)果顯示，在K27位點(diǎn)存在的情況下泛素化水平最高（a）。之后用多種K27位點(diǎn)相關(guān)泛素化連接酶處理，其中ITCH顯著增強(qiáng)了BRAF的泛素化水平（b）。那么ITCH是否是通過K27位點(diǎn)對(duì)BRAF位點(diǎn)進(jìn)行泛素化的呢？共轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示K27、K29位點(diǎn)存在的情況下，BRAF的泛素化水平均顯著增加（e）。將K27、K29位點(diǎn)分別突變，發(fā)現(xiàn)K29位點(diǎn)突變后不影響ITCH的效果，綜上結(jié)果表明ITCH是通過K27位點(diǎn)對(duì)BRAF位點(diǎn)進(jìn)行泛素化（f-i）。

Fig 2. ITCH通過激酶結(jié)構(gòu)域與BRAF相互作用

之后作者將重點(diǎn)放在闡明ITCH引起的BRAF泛素化如何決定黑色素瘤環(huán)境中的BRAF / MEK / ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)。GST pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了ITCH與BRAF直接互作（d）。作者發(fā)現(xiàn)BRAF的C末端激酶結(jié)構(gòu)域直接與ITCH結(jié)合（e），ITCH利用其WW 結(jié)構(gòu)域與BRAF互作（f）。在BRAF的激酶結(jié)構(gòu)域中鑒定出許多非PPxY脯氨酸豐富的基序（g，h）。BRAF蛋白上S675/P676 或者P751/P754位點(diǎn)突變均可導(dǎo)致其與ITCH結(jié)合減少。總結(jié)以上結(jié)果，在BRAF激酶結(jié)構(gòu)域中查明了兩個(gè)富含脯氨酸的基序，這些基序介導(dǎo)了ITCH-BRAF相互作用，以促進(jìn)BRAF的K27位點(diǎn)多泛素化。

備注：

1.NEDD4家族泛素E3連接酶（包括ITCH）通過其WW結(jié)構(gòu)域與其底物相互作用。

2.除了PPxY基序，NEDD4家族E3連接酶還通過其他富含脯氨酸的基序（例如PPLP，pSP或pTP基序）募集底物。

Fig 3. ITCH耗竭會(huì)減弱MEK / ERK信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)。

作者接下來通過構(gòu)建Itch缺失突變體株來研究ITCH是否是MEK / ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要上游調(diào)節(jié)劑。與MEFs WT相比，Itch缺失的MEFs表現(xiàn)出降低的MEK / ERK活性（a），表明ITCH對(duì)BRAF功能的正調(diào)節(jié)作用。TNFα使得MEFs WT細(xì)胞中MEK / ERK信號(hào)快速激活，但是Itch缺失的MEFs細(xì)胞則對(duì)TNFα的刺激不敏感（b），在其他黑色素瘤細(xì)胞中也有同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（d-e）。提示細(xì)胞因子誘導(dǎo)的MEK/ERK激活至少部分是通過ITCH途徑的，且調(diào)節(jié)MEK / ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴E3-連接酶活性（f-h）。

另外，作者發(fā)現(xiàn)ITCH敲降抑制細(xì)胞增殖（i，j），ITCH耗竭顯著抑制了p-MEK / p-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。綜上表明，ITCH可以積極調(diào)節(jié)BRAF / MEK / ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)，并促進(jìn)BRAF WT黑色素瘤細(xì)胞的存活。

Fig 4. 細(xì)胞因子促進(jìn)BRAF泛素化和激活

TNFα處理后誘導(dǎo)快速增加p-MEK/p-ERK水平，同時(shí)JNK水平上升（a，b），表明BRAF功能與 JNK/ITCH途徑激活具有相關(guān)性。在黑色素細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中，TNFα處理后BRAF 泛素化增加（c），而ITCH耗竭的黑色素瘤細(xì)胞中p-MEK/p-ERK對(duì)TNFα治療無效（d）。MEF中的Itch缺失可消除TNFα介導(dǎo)的BRAF泛素化（e）。MEF中Jnk1和Jnk2的缺失導(dǎo)致ITCH失活的同時(shí)導(dǎo)致p-MEK和p-ERK的水平降低（f）。此外，在黑色素瘤細(xì)胞中敲低JNK1和JNK2抑制了MEK和ERK活性（g）。與對(duì)照細(xì)胞相比，用TNFα或IL-1β處理的黑素瘤細(xì)胞顯示出細(xì)胞生長(zhǎng)增加（h）。腫瘤環(huán)境中促炎細(xì)胞因子的主要來源之一是腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞，特別是M2巨噬細(xì)胞。通過黑色素瘤細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)（i），作者發(fā)現(xiàn)M2型的THP1細(xì)胞可以促進(jìn)WM3918細(xì)胞的增殖（j，k），與對(duì)照細(xì)胞相比，在與M2型的THP1細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞中觀察到p-JNK，p-MEK和p-ERK水平升高（l）。

總結(jié)，細(xì)胞因子刺激激活JNK并促進(jìn)ITCH激活進(jìn)而促進(jìn)BRAF泛素化和隨后MEK / ERK信號(hào)升高。

Fig 5. 泛素化缺乏的BRAF無法激活MEK / ERK

那么，BRAF的泛素化是否是下游因子激活的關(guān)鍵因子呢？與BRAF^WT相比，除K699R外，所有KR突變體均表現(xiàn)低MEK / ERK活性（a）。BRAF^KR突變體與BRAF^WT表現(xiàn)出相似的磷酸化MEK1的活性（b）。此外，BRAF^WT/BRAF^KR在促進(jìn)GST-MEK1磷酸化方面表現(xiàn)出相同的激酶動(dòng)力學(xué)（c，d），表明KR突變幾乎不影響B(tài)RAF蛋白的構(gòu)象。缺乏ITCH結(jié)合缺陷的BRAF S675A / P676A和P751A / P754A突變體在促進(jìn)細(xì)胞中MEK / ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面表現(xiàn)出降低的活性（e）。與表達(dá)BRAF^WT的細(xì)胞相比，在表達(dá)BRAF^5KR的細(xì)胞中，TNFα刺激極少觸發(fā)p-MEK和p-ERK的活化（g）。以上證明，泛素化缺陷型BRAF^5KR的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激無效。

Fig6. 泛素化消除了BRAF / 14-3-3結(jié)合的抑制作用

與未修飾的BRAF相比，泛素化的BRAF與14-3-3的相互作用降低（a）。但是14-3-3與5KR-BRAF或ITCH結(jié)合區(qū)缺乏的BRAF的結(jié)合不受影響（b）。TNFα處理黑色素瘤細(xì)胞后，內(nèi)源性BRAF與14-3-3蛋白的結(jié)合被減弱（c）。14-3-3二聚體介導(dǎo)的p-S365和p-S729位點(diǎn)的分子內(nèi)相互作用使BRAF處于封閉的非活性構(gòu)象，兩個(gè)BRAF蛋白的分子通過p-S729位點(diǎn)與14-3-3二聚體結(jié)合而變得更加穩(wěn)定，作者發(fā)現(xiàn)S365或S729的突變導(dǎo)致與14-3-3的結(jié)合減少，泛素化以及未泛素化的S365A-BRAF與14-3-3結(jié)合無顯著差異（d）。因此，該結(jié)果證明K27位點(diǎn)的多聚泛素特異性干擾14-3-3與p-S365之間的結(jié)合（e）。

由于14-3-3與C末端p-S729位點(diǎn)的結(jié)合可促進(jìn)RAF蛋白二聚化。

我們接下來試圖確定BRAF多泛素化是否控制BRAF二聚化。作者假設(shè)K27連接的聚泛素鏈可能募集PP2A磷酸酶去磷酸化p-S365，從而導(dǎo)致與細(xì)胞中14-3-3的結(jié)合進(jìn)一步減少（e），從而維持BRAF 驅(qū)動(dòng)下游MEK / ERK信號(hào)的活動(dòng)。作者發(fā)現(xiàn)，與未修飾的BRAF相比，泛素化的BRAF與PPP2R2A亞基具有更強(qiáng)的結(jié)合力（g）。為了支持PP2A在調(diào)節(jié)BRAF活性中的關(guān)鍵作用，作者發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤細(xì)胞中，PPP2CA或PPP2R2A的耗竭導(dǎo)致p-S365-BRAF升高，MEK / ERK活性降低（k，1）。綜上說明了BRAF K27位點(diǎn)的泛素化在破壞14-3-3介導(dǎo)的BRAF抑制中的獨(dú)特作用。

備注：BRAF的上游調(diào)節(jié)子。14–3–3蛋白識(shí)別RSxpSxP或RxxxpSxP基序，其中pS代表磷酸絲氨酸。p-S365，而p-S729是在BRAF中發(fā)現(xiàn)的14–3–3相互作用位點(diǎn)。

PP2A家族：PPP2CA亞基和B55亞家族調(diào)節(jié)性亞基PPP2R2A與BRAF具有很強(qiáng)的結(jié)合力。PP2A全酶由三個(gè)亞基組成：支架亞基A，催化亞基C和四個(gè)調(diào)節(jié)亞基B。

Fig7. 泛素缺乏的BRAF致瘤性較低

那是否泛素缺乏的BRAF突變體在BRAF^WT的黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲中表現(xiàn)出功能受損。作者發(fā)現(xiàn)與BRAF^WT相比，泛素化缺乏的BRAF^5KR無法促進(jìn)BRAF缺失的黑色素瘤細(xì)胞中MEK / ERK的活化（a），且表達(dá)BRAF^5KR的WM1346細(xì)胞對(duì)TNFα介導(dǎo)的MEK / ERK活化具有抵抗力，并伴隨泛素化降低（b）。在BRAF敲除的細(xì)胞系中重建BRAF^WT后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖被促進(jìn)，而BRAF ^5KR重建組則表現(xiàn)細(xì)胞增殖活性的降低（c，d）。表明K27位點(diǎn)的多泛素化在維持黑素瘤細(xì)胞中BRAF活性中起著至關(guān)重要的作用。

此外，表達(dá)BRAF^5KR的細(xì)胞表現(xiàn)出低的基質(zhì)膠（e，f）內(nèi)皮細(xì)胞（g，h）的侵襲能力。M2分化的THP1細(xì)胞刺激了BRAF^WT WM3918細(xì)胞的生長(zhǎng)，但在BRAF^5KR的細(xì)胞中卻沒有這種作用（i，j）。

BRAF^WT的表達(dá)促進(jìn)了免疫缺陷小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，但帶有BRAF^5KR的WM1346細(xì)胞體內(nèi)致瘤性較?。╩，n）。

綜上，與BRAF^WT相比（促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖和侵襲），泛素化不足的BRAF^5KR突變體活性較低，且表現(xiàn)出受損的致癌功能，這些數(shù)據(jù)支持非典型泛素化BRAF的翻譯后修飾，以維持黑色素瘤細(xì)胞中MEK / ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)。