譯： CircDIDO1通過編碼新的DIDO1-529aa蛋白和調(diào)節(jié)PRDX2蛋白穩(wěn)定性抑制胃癌進展

MOLECULAR THERAPY (IF：11.454/Q1) DOI:/10.1016/j.ymthe.2021.08.025

話不多說，我們先來看這篇文章的研究思路圖

circDIDO1在胃癌中的作用機制的建議模型

（CircDIDO1是一種新的GC抑瘤環(huán)狀RNA。 circDIDO1通過編碼DIDO1-529aa蛋白抑制PARP1活性，促進rbx1介導(dǎo)泛素化和PRDX2降解，從而抑制GC的生長和侵襲性）

注： GC細胞=胃癌細胞

DIDO1=(死亡誘導(dǎo)因子消除因子1)基因(稱為circDIDO1)

看圖得結(jié)論：本文集合了circRNA研究的2大熱點：

① circRNA編碼多肽蛋白

②circRNA結(jié)合蛋白并促進泛素化降解

精華提煉：

● 在結(jié)論上，作者發(fā)現(xiàn)了：

一種新的環(huán)狀RNA，即circDIDO1，在GC中具有強大的抑癌活性。 可分別通過抑制PARP1和促進PRDX2泛素化降解，一起抑制GC細胞的生長和侵襲性。

● 在機制上，作者發(fā)現(xiàn)了：

circDIDO1編碼了一個新的529 aa蛋白，該蛋白直接與聚adp -核糖聚合酶1 (PARP1)相互作用并抑制其活性。 CircDIDO1還特異性結(jié)合過氧化物還原蛋白2 (PRDX2)，促進rbx1介導(dǎo)的PRDX2的泛素化和降解，導(dǎo)致其下游信號通路失活。

●在研究意義上，作者認為：

研究擴展了對circRNA在胃癌發(fā)病機制中的作用的理解，并提出了一種新的circRNA，circDIDO1作為GC的潛在生物標(biāo)志物。

接下來枯燥且正經(jīng)的學(xué)習(xí)開始了，趕緊學(xué)套路，發(fā)10分！

研究方法:

通過生物信息學(xué)分析確定hsa_circ_0061137(稱為circDIDO1)在GC中的異常表達。 進行了功能獲得和功能喪失的研究，以檢查circDIDO1在GC進展中的生物學(xué)作用。 并采用標(biāo)記RNA親和純化、質(zhì)譜、免疫熒光、免疫共沉淀和Western blot方法鑒定環(huán)狀RNA相互作用和環(huán)狀RNA編碼的蛋白。 之后通過RNA-seq、RT-qPCR和Western blot分析circRNA調(diào)控的下游靶基因和信號通路； 最后采用小鼠腫瘤模型分析circDIDO1對胃癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。

看到這里是不是覺得...

確實！ 小編也這么覺得，所以。 。 。

還不快趕緊學(xué)起來自己也整個10分？!

Come，過一下這篇文章的結(jié)果，想學(xué)的趕緊碼。

1、CircDIDO1在GC中下調(diào)，低水平預(yù)示預(yù)后不良

為了鑒定GC中新的環(huán)狀RNA，從Gene Expression Omnibus 中提取了環(huán)狀RNA芯片數(shù)據(jù)(GSE83521和GSE89143)分析circRNA表達譜。（不自己做測序，空手套白狼你學(xué)廢了?。?）通過對這兩組數(shù)據(jù)集的差異表達環(huán)狀RNA進行交叉，作者確定了8個與相鄰正常組織相比在GC組織中顯著下調(diào)的環(huán)狀RNA(圖1a)。 考慮到相對表達水平和檢測特異性，作者選擇hsa_circ_0061137作為下一步研究的目標(biāo)。 Hsa_circ_0061137是由長度為1787個核苷酸(因此稱為circDIDO1)的DIDO1 (death inducer obliterator 1)基因線性轉(zhuǎn)錄本的外顯子2-6的反向剪接形成的(圖1b)。 PCR結(jié)果顯示，從GC細胞的cDNA中擴增circDIDO1，而從gDNA中擴增不出circDIDO1，而從兩者中聚合的引物均能擴增線性轉(zhuǎn)錄本(圖1c)。 由此可見，測序結(jié)果證實了不同引物擴增的PCR產(chǎn)物中存在反向剪接位點(圖1b)。RNAse R降解試驗結(jié)果表明，線性轉(zhuǎn)錄的DIDO1被RNAse R處理降解，而circDIDO1對該處理具有抗性(圖1d)。 RNA-FISH檢測結(jié)果顯示circDIDO1分布于GC細胞的細胞核和細胞質(zhì)中(圖1e)。 綜上所述，這些結(jié)果表明circDIDO1是GC中新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA。 然后作者檢測circDIDO1在人胃癌細胞和組織中的表達。 QRT-PCR結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細胞相比，circDIDO1在GC細胞中明顯下調(diào)(圖1f)。 此外，作者檢測了102對胃癌患者腫瘤組織和正常組織中circDIDO1的表達，發(fā)現(xiàn)與配對正常組織相比，circDIDO1在胃癌患者腫瘤組織中的表達明顯下調(diào)(圖1g)。 CircDIDO1表達水平與腫瘤大小和遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(表S1)。 此外，circDIDO1水平低的GC患者的生存時間明顯短于高水平的GC患者(圖1h)。 綜上所述，這些結(jié)果表明circDIDO1在GC中低表達，其下調(diào)預(yù)示預(yù)后不良。

這段circRNA鑒定的操作看完的感想來，大聲告訴我：

是不是擱你你也會？

圖1： CircDIDO1被鑒定為GC中下調(diào)的circRNA

2、CircRNA在胃癌中具有抑癌作用

接下來，通過功能增益和功能缺失研究探索circDIDO1在GC中的生物學(xué)作用。 細胞生長、菌落形成、transwell遷移、基質(zhì)侵襲分析和流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，circDIDO1過表達顯著抑制了增殖(圖2a和2b)、遷移(圖2a和2b)。 2c)和GC細胞的侵襲能力(圖2d)，同時促進其凋亡(圖2e)。 相反，circ-DIDO1基因敲除有相反的效果(圖S1)。 然后評估了circDIDO1對小鼠模型GC生長的影響。 如圖2f所示，circDIDO1過表達組在接種30天后腫瘤的重量明顯低于對照組。 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組相比，circDIDO1過表達組ki -67陽性增殖細胞百分率降低，tunel陽性凋亡細胞百分率升高(圖2g)。

為了分析circDIDO1對胃癌轉(zhuǎn)移的影響，作者通過向裸鼠腹腔注射控制和circDIDO1過表達細胞建立了腹腔轉(zhuǎn)移模型。 4周后處死裸鼠，觀察腹腔轉(zhuǎn)移灶和肝轉(zhuǎn)移灶。 與對照組相比，circDIDO1過表達組腸系膜腫瘤體積和重量明顯變小(圖2h)。 由此可見，circDIDO1過表達組的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯低于對照組(圖2h)。 免疫組化染色結(jié)果顯示，與對照組相比，circDIDO1過表達組肝轉(zhuǎn)移組織中EMT標(biāo)記物E-cadherin表達明顯上調(diào)，N-cadherin表達下調(diào)(圖S2a)。 這表明，circDIDO1在胃癌中具有抑癌作用。

圖2： CircDIDO1過表達抑制GC的生長和轉(zhuǎn)移

這段circRNA對腫瘤細胞的體內(nèi)外作用看完的感想來，大聲告訴我：

是不是擱你你也會？

3、CircDIDO1編碼一個529aa腫瘤抑制蛋白

通過circRNADb軟件進行的生物信息學(xué)分析顯示，circDIDO1具有核糖體進入位點(IRES)、開放閱讀框(ORF)和m6A修飾(圖S3a)，表明它可能具有編碼蛋白質(zhì)的潛力。 circDIDO1的反向剪接位點形成一個終止密碼子（這里是亮點，注意看！ 怎么分析circRNA具有編碼aa的潛力！ Maybe你還沒學(xué)會，噓~）。 circDIDO1預(yù)測的ORF可能編碼一個推測的529 aa蛋白(圖3a)，稱為DIDO1-529aa。 當(dāng)用針對DIDO1蛋白的抗體檢測時，作者發(fā)現(xiàn)circDIDO1過表達生成了一個分子量接近DIDO1的新蛋白(圖S3b)。 CircDIDO1過表達對DIDO1基因表達無影響(圖S3c)。

為了證實circDIDO1具有蛋白編碼能力，在circDIDO1全長序列的最后一個核苷酸(即circDIDO1的預(yù)測終止密碼子)前構(gòu)建了一個帶有FLAG標(biāo)簽的circDIDO1過表達載體(circDIDO1- FLAG)，并將其轉(zhuǎn)染到293 T細胞中。 Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)LAG抗體可檢測新生蛋白的表達，說明circDIDO1具有蛋白編碼能力(圖3b)。 隨后，用抗flag抗體對新生蛋白進行IP純化，進一步驗證。 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)果表明，新生蛋白的氨基酸序列與預(yù)測蛋白完全匹配，證實DIDO1-529aa是circDIDO1翻譯而來(圖3c和圖S3d)。 然后將DIDO1-529aa的氨基酸序列與DIDO1蛋白的氨基酸序列進行比較。 作者發(fā)現(xiàn)DIDO1-529aa與DIDO1蛋白亞型a (DIDO1-a)具有相似的氨基酸序列。 與DIDO1-a相比，DIDO1-529aa失去了c端最后33個氨基酸，即DIDO1-a的核輸出序列(NES)(圖3d)。（這里是亮點，注意看！ 這個circRNA編碼出來的DIDO1-529aa沒有核輸出序列，所以翻譯出來后只要進了細胞核就出不去啦！ ）作者進一步通過免疫熒光法確定了DIDO1-529aa在GC細胞中的分布，發(fā)現(xiàn)DIDO1-529aa主要定位于細胞核(圖3d)。 （這里有一點嗷~~小編弱弱提示下，作者沒有說這個DIDO1-529aa有沒有核定位序列嗷，如果沒有核定位序列，僅缺少核輸出序列，也是會在胞質(zhì)里的嗷~~當(dāng)然我們看IF結(jié)果，應(yīng)該是DIDO1-529aa有NLS但沒有NES嗷~~）為了進一步探討DIDO1-529aa的功能，作者構(gòu)建了帶Flag標(biāo)簽的線性形式的DIDO1-529aa載體(DIDO1-529aa-Flag)，并將其轉(zhuǎn)染到GC細胞中。 功能檢測結(jié)果顯示，過表達DIDO1-529aa可抑制GC細胞增殖、遷移和侵襲，但可促進GC細胞凋亡(圖3e-i)。 綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明circDIDO1編碼一個具有抑癌活性的529aa蛋白。

這段circRNA對編碼aa看完的感想來，大聲告訴我：

是不是擱你你就不一定會了？

圖3. CircDIDO1編碼一個新的529 aa蛋白

4、CircDIDO1干擾GC細胞中PRDX2的下游通路

為了分析circDIDO1調(diào)控的下游信號通路，對控制和circDIDO1過表達的GC細胞進行了RNA-seq，并對基因表譜進行了聚類和通路分析(圖6e,f)。（注意哦~10分以上的原創(chuàng)高通量測序來了！ ）與對照組相比，circDIDO1過表達組中有134個基因表達上調(diào)，52個基因表達下調(diào)(表S4)。 通過qRT-PCR驗證了circDIDO1過表達組中幾個已鑒定基因的表達改變(圖S6)。 通路分析表明，差異表達基因在與癌癥進展密切相關(guān)的信號通路中富集，如Wnt/β-catenin、MAPK和PI3k/ Akt通路(圖6f)。 前期研究表明PRDX2蛋白是這些通路的關(guān)鍵調(diào)控因子。 為此，作者檢測了circDIDO1是否通過下調(diào)GC細胞中的PRDX2來調(diào)控這些通路。 Western blot結(jié)果證實circDIDO1在GC細胞和腫瘤組織中，過表達使這些通路失活(圖6g和圖S2b)，這與在PRDX2敲低的GC細胞中觀察到的變化模式相似。 特別是circDIDO1過表達抑制了GC細胞中β-catenin的表達和活性(圖6h和圖S7)，這與之前的研究一致，PRDX2是其他癌細胞中β-catenin信號通路的重要調(diào)控因子。

圖4. DIDO1-529aa與PARP1相互作用

圖5： CircDIDO1通過雙重機制在GC中發(fā)揮抑癌作用

圖6： CircDIDO1與GC細胞中的PRDX2蛋白相互作用

5、CircDIDO1促進RBX1介導(dǎo)的泛素化和PRDX2的降解

進一步用MG-132檢測circDIDO1是否調(diào)節(jié)PRDX2蛋白的穩(wěn)定性。 發(fā)現(xiàn)MG-132預(yù)處理可防止circDIDO1過表達誘導(dǎo)的GC細胞中PRDX2蛋白的降解(圖7a)。 與此相一致，環(huán)己亞胺(CHX)檢測結(jié)果顯示，circDIDO1過表達組的PRDX2蛋白半衰期短于對照組(圖7b)，表明circDIDO1加速了PRDX2蛋白在GC細胞中的降解。 為了分析circDIDO1是否通過泛素化依賴機制促進PRDX2蛋白降解，作者利用PhosphoSite Plus軟件預(yù)測PRDX2蛋白中潛在的泛素修飾位點。 作者發(fā)現(xiàn)PRDX2蛋白具有多個泛素修飾位點(圖7c)。 然后作者將circDIDO1與泛素共轉(zhuǎn)染GC細胞，并用MG-132處理轉(zhuǎn)染的細胞。 Co-IP檢測結(jié)果顯示circDIDO1過表達顯著增加了泛素化PRDX2蛋白的水平(圖7d)。 然后作者通過Co-IP和質(zhì)譜分析檢測PRDX2結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)PRDX2與一系列泛素連接酶結(jié)合(圖7e和表S4)。 作者證實，PRDX2與SCF泛素化復(fù)合物的E3連接酶RBX1結(jié)合(圖7f)， circDIDO1過表達顯著促進了PRDX2和RBX1蛋白之間的相互作用(圖7g)。 總的來說，這些數(shù)據(jù)表明circDIDO1在GC細胞中促進rbx1介導(dǎo)的PRDX2泛素化和降解。

這段circRNA介導(dǎo)蛋白的泛素化降解看完的來，大聲告訴我：

是不是擱你你就不一定會了？

但是我發(fā)現(xiàn)好像circRNA在這里也僅僅是一個促進的作用，并沒有和機制圖中畫的那樣直接結(jié)合上去了~~

圖7： CircDIDO1促進PRDX2的泛素化和RBX1的降解

好了，文章就到這里了。 看完是不是覺得自己又行了？ ！ ！ ！

我還能做實驗！

有感興趣的大漂亮大帥鍋，記得關(guān)注我們，么么噠