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    染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）是研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的核心技術(shù)，廣泛應用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、組蛋白修飾、表觀遺傳調(diào)控及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

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ChIP實驗原理與分類

1. 基本原理

ChIP通過甲醛交聯(lián)固定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)-DNA復合物，超聲或酶切破碎染色質(zhì)，利用特異性抗體富集目標蛋白結(jié)合的DNA片段，最終通過PCR、qPCR或高通量測序（ChIP-seq）進行定性和定量分析。

2. ChIP技術(shù)分類

實驗前準備

1. 關(guān)鍵試劑與設備

——細胞/組織樣本：1×10^6–10^7細胞/ChIP

——交聯(lián)試劑：37%甲醛（終濃度1%）、甘氨酸（終止液）

——裂解緩沖液：RIPA buffer（含蛋白酶抑制劑）

——抗體：ChIP級抗體（推薦Abcam、CST、Diagenode）

——磁珠：Protein A/G磁珠（Dynabeads?）

——片段化設備：Covaris超聲儀（推薦S220/Sonicator 3000）

——DNA純化試劑盒：Qiagen MinElute或Zymo DNA Clean & Concentrator

2. 抗體選擇與驗證

抗體特異性驗證：WB或IP驗證靶蛋白結(jié)合能力

ChIP適用性驗證：查閱ENCODE數(shù)據(jù)庫或已發(fā)表文獻

對照設置：

●陽性對照：H3K27me3（異染色質(zhì)）、H3K4me3（活躍啟動子）

●陰性對照：IgG同型對照

●Input對照：1%未免疫沉淀染色質(zhì)

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標準ChIP實驗流程

1. 細胞交聯(lián)與染色質(zhì)制備

甲醛交聯(lián)：

細胞培養(yǎng)至80%匯合度，加入1%甲醛（終濃度），室溫交聯(lián)10min

加入125mM甘氨酸（終濃度）終止反應5min

細胞裂解：

預冷PBS洗滌2次

加入含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液，冰上裂解10min

離心（4℃, 2000g, 5min）收集細胞核

2. 染色質(zhì)片段化

A. 超聲破碎（適用于X-ChIP）

推薦參數(shù)（Covaris S220）：

峰值功率：75W

占空比：5%

循環(huán)次數(shù)：200次

目標片段大?。?00–500bp（電泳驗證）

B. MNase酶切（適用于N-ChIP）

37℃消化5–15min，EDTA終止反應

電泳檢測單核小體（~147bp）

3. 免疫沉淀（IP）

預清除：加入Protein A/G磁珠，4℃孵育1h減少非特異性結(jié)合

抗體孵育：

取50–100μg染色質(zhì)，加入1–5μg抗體，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜

磁珠結(jié)合：

加入Protein A/G磁珠，4℃孵育2h

洗滌步驟（嚴格去除非特異結(jié)合）：

Low Salt Wash Buffer（1×）

High Salt Wash Buffer（1×）

LiCl Wash Buffer（1×）

TE Buffer（2×）

4. 交聯(lián)逆轉(zhuǎn)與DNA純化

交聯(lián)逆轉(zhuǎn)：

加入Elution Buffer（1% SDS, 0.1M NaHCO?），65℃孵育6h

蛋白酶消化：

加入RNase A（37℃ 30min）和Proteinase K（55℃ 1h）

DNA純化：

使用MinElute柱純化DNA，洗脫體積≤20μL

質(zhì)量控制（QC）與數(shù)據(jù)分析

1. 關(guān)鍵QC指標

2. 下游分析技術(shù)

ChIP-qPCR：定量特定基因組位點（如啟動子、增強子）

ChIP-seq：全基因組結(jié)合位點分析（推薦Illumina NovaSeq）

CUT&Tag：低樣本量（500–50,000細胞）的高靈敏度替代方案

常見問題與優(yōu)化策略

單細胞ChIP-seq（scChIP-seq）：研究細胞異質(zhì)性

CUT&RUN/CUT&Tag：無需交聯(lián)，適用于珍貴樣本

多組學整合分析：ChIP-seq + ATAC-seq + RNA-seq

ChIP實驗的成功依賴于嚴格的實驗設計、抗體選擇和質(zhì)控步驟。建議初次實驗者采用陽性對照（如H3K27ac）優(yōu)化條件，并結(jié)合ChIP-seq驗證全局結(jié)合譜。隨著技術(shù)進步，CUT&Tag等新方法正逐步替代傳統(tǒng)ChIP，為低樣本量研究提供更高靈敏度解決方案。

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