亚洲国产日韩不卡综合,明星ai换脸磁力资源种子搜索,成人性闻CCAV下载,欧美日本国产在线a小说v,亚洲欧洲综合一区二区三区,里中结衣av中文字幕

目前，由PCR介導的定點突變相比于其他突變技術具有周期短、成功率高、不受酶切位點限制等優(yōu)點，是使用最普遍的定點突變方法。

DNA分子中由于發(fā)生堿基對的增添、缺失或改變進而引起基因結構的改變，稱為基因突變。

定點突變 （mutagenesis）是通過PCR等方法向目的DNA片段中引入突變，包括堿基的添加、刪除、點突變等。該技術能迅速、高效地改變DNA所表達的目的蛋白的性狀及表征，是研究蛋白質結構和功能之間復雜關系的有力工具，也是研究人員在實驗室中改造、優(yōu)化基因常用的一種非常有用的手段。

定點突變這么常見的技術，實驗如何進行呢？

一步法（直接以質粒為模板）。為了更好的擴增效率，可以將正因和反向引物分開擴增，避免二聚體的產生。實驗流程如下（轉載自科學網mzxg的博客）：

1、引物設計

設計一對正向和方向引物。建議引物長度為30-40bp。

基本的引物設計原則就不贅述了，這里要加上一條突變引物的設計原則。

一般是以突變的堿基為中心，兩邊加上12-20 bp序列，若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，引物至少要11-12個base pair才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個base pair，并且合成多一條反向互補的引物。

2、各20ul體系

18ul 混合物+2uL     primer F

18ul 混合物+2uL     primer R

在兩個tube中配好反應體系后，置于PCR儀進行反應，反應程序為：

98℃             1 min

98℃             10sec

60℃(可調整)     20sec          

72℃          根據質粒大小調整

steps 2-4        for 12 cycles

72℃              5 min

4℃保存

3、反應完成后，將兩個反應體系混合后成40ul體系，并且補加適量的高保真聚合酶（如Q5），然后使用以上反應程序繼續(xù)反應16 cycles。

4、得到的PCR產物加入1ul DpnI 酶和4ul的10*NEB cutsmart buffer消化模板質粒（原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA）置于37度反應1h（或者2-3h，保證處理干凈）。

5、取5ul 跑膠看是否有條帶，剩余的取部分做細菌轉化，涂板。

6、12h 后挑取3-5個克隆送測序。

除了一步法，還有很多其他方法可以選擇，比如搭橋法/重疊延伸PCR，是通過三次PCR實現的。

重疊PCR法原理圖

每個突變點需要合成一對相互Overlap（重疊）20－25bp的突變引物，你的試驗中需合成4對（4個點）突變引物。 另外兩側需要合成一對引物，以便擴增全長序列（稱為全長引物）。

舉一突變點為例，如需突變A點。先作兩個PCR：1使用正向全長引物和A突變點的反向突變引物；2突變點A的正向突變引物和全長反向引物。而后回收兩段PCR產物，取少量產物在PCR體系中先自延伸十周，而后加入正向和反向全長引物擴增全片斷?；厥盏诙喌?/span>PCR產物，酶切，接入克隆載體，測序。測序結果如正確則第一個位點突變完成。 以此類推，突變剩下的位點。

優(yōu)點是：成功率高，應用廣泛。

缺點是：擴增的序列盡量不要太長，否則成功率不高。需要對中間產物進行純化。

倘若質粒模板無法正常擴增，可能的原因有哪些？有哪些解決方法呢？點此跳轉