PCR是生物領(lǐng)域中最基礎(chǔ)，也是尤為重要的一環(huán)
今天給大家講述一些
PCR應(yīng)該了解的知識(shí) 與 實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問題的解決辦法
首先給大家詳細(xì)介紹下其原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）原理：
即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。
介紹了原理，少不了得說(shuō)其幾個(gè)重要體系成份：
1.模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA、也可以是細(xì)菌、組織樣品等。
2.引物（Primer）：確定擴(kuò)增目的序列打的特異性；確定擴(kuò)增引物長(zhǎng)度。
3.DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推動(dòng)PCR反應(yīng)進(jìn)行的機(jī)器。
4.緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。
5.脫氧核苷酸（dNTP）:DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。
6.Mg、K離子增強(qiáng)劑。
而我們?cè)赑CR實(shí)際操作過(guò)程中會(huì)遇到很多不可避免的問題，比如說(shuō)：PCR產(chǎn)物條帶拖尾，有雜帶，更嚴(yán)重的是除了marker外，啥條帶都看不到。
那我們應(yīng)該如何有效的避免出現(xiàn)這些問題呢？
首先得找出出現(xiàn)這些問題的原因，才能有效解決問題。
常見的問題有很多種，但絕大部分能總結(jié)出以下幾點(diǎn)。
問題一：完全沒有條帶
1.確認(rèn)試劑是否存在質(zhì)量問題或者加樣時(shí)出錯(cuò)，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。
2.檢查模板DNA是否正確或者存在特殊結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致模板與引物無(wú)法結(jié)合。
3.引物或反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)不合理。
問題二：有很多非特異性條帶
1.反應(yīng)體系被污染。
2.引物特異性差。
3.退火溫度不合適。
問題三：目的條帶弱
1.聚合酶活性過(guò)低。
2.循環(huán)次數(shù)偏低。
3.模板DNA濃度過(guò)低。
問題四：PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾
1.DNA聚合酶過(guò)多或酶活性差。
2.dNTP和Mg離子濃度過(guò)高。
3.退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。
4.模板DNA用量過(guò)大或模板DNA不純。
5.引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
知道了問題的出現(xiàn)原因，就能有效的針對(duì)并改變PCR條件，跑出漂亮的條帶了。最后祝大家，PCR每次都能成功擴(kuò)出目的條帶。
湘公網(wǎng)安備
