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        大家好，今天跟普拉特澤生物一起學(xué)習(xí)的是GST pull down實驗的操作步驟。上期咱們簡單介紹了一下GST pull down實驗，是一個近年來受廣大科研人員關(guān)注的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術(shù)，普拉特澤生物分子檢測平臺專業(yè)為大家提供GST pull down檢測外包服務(wù)，提供真實、高質(zhì)量的實驗結(jié)果。現(xiàn)在我們來跟著技術(shù)來看看GST pull down實驗的操作步驟：

        一、GST-a融合蛋白的制備

        1、GST-a融合蛋白的表達

        (1)將目的蛋白與GST的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株中；

        (2)挑取單克隆到含有5mL LB培養(yǎng)基（加入5 μL氨芐）的10 mL試管里，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

        (3)將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500mL LB（含500 μL氨芐）的1L錐形瓶中，37℃，200 rpm培養(yǎng)數(shù)小時；

        (4)測定OD600值，當(dāng)OD600達到0.6左右時，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在20℃，200rpm條件下培養(yǎng)10-16h（通常需要進行預(yù)實驗以確定最佳IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和時間）；

        (5)誘導(dǎo)適當(dāng)時間后，將菌液分次倒入50 mL離心管中，4℃ 4000 rpm離心10分鐘，然后棄去上清，收集管底菌體，如暫時不用，可將菌體保存于-80℃冰箱中；

        (6)先加入少量PBS于離心管中，離心5-10 min后棄去上清，再按每10 mL菌液沉淀1 mL PBS的量加入相應(yīng)的PBS，渦旋振蕩，使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中；

        (7)把混合菌體置于冰水浴中，用超聲儀進行破碎。每次超聲破碎20 s，間隔30 s（破碎時間、破碎次數(shù)和間隔時間視具體情況而定），經(jīng)過適當(dāng)時間超聲后，溶液會顯得澄清；

        (8)將超聲后的溶液4℃ 4000 rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>

        2、GST-a融合蛋白的純化

        (1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B，4℃搖床上緩慢搖動30~60 min;

        (2)4℃，4000rpm離心5 min，棄去上清，該Sepharose上結(jié)合了GST-a融合蛋白；

        (3)加入200 μL預(yù)冷的PBS溶液，輕晃懸浮珠子，將Sepharose洗滌一次，4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清，重復(fù)此步驟3次；

        (4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體，但注意不要吸走珠子，即可獲得結(jié)合GST-a的Sepharose。

        二、體外蛋白的結(jié)合

        1、將結(jié)合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中，加入20 μL含有b蛋白的溶液，同時采用結(jié)合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對照，在搖床上晃動4-8h（4℃）；

        2、4℃，4000 rpm離心5 min，棄去上清液；

        3、沿壁加入200μL預(yù)冷的緩沖液對Sepharose進行洗滌，

        4、4℃，4000rpm離心5 min，棄上清，該步驟重復(fù)3次；

        5、吸干Sepharose上面的液體后，加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液，沸水浴5 min，放入-20℃冰箱備用；

        6、通過SDS-PAGE和Western blot進行檢測。

        好啦，那關(guān)于GST pulldown實驗步驟就分享完啦，如果您也在設(shè)計GST pull down實驗的話可以留言給我們跟技術(shù)一起討論設(shè)計出最好的實驗方案哦~如果您覺得實驗讓您頭疼的話也可以把GST pull down實驗外包給我們，實驗交給我，思考留給您~