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        酵母雙雜交實驗步驟由普拉特澤生物技術跟大家總結分享，酵母雙雜交系統(tǒng)正是利用了GAL4的功能特點，通過兩個雜交蛋白在酵母細胞中的相互結合及對報告基因的轉錄激活來捕獲新的蛋白質。普拉特澤生物——分子檢測平臺專業(yè)承接酵母雙雜實驗代做服務，今天技術就跟大家來分享實驗的操作步驟，一起來學習吧！

            一、構建重組Activation Domain（AD）融合的重組質粒（pGADT7載體）以及Binding Domain（BD）融合的重組質粒（pGBKT7載體）；

            二、雙向酵母雙雜交實驗鑒定蛋白質間的相互作用

            1、 酵母轉化中DNA 混合液的配制

        在制備酵母感受態(tài)的過程中配制下面的DNA 轉化混合液（1×）：

            2、酵母感受態(tài)細胞的制備以及共轉化，下面是所需用量為10 個轉化實驗的酵母感受態(tài)細胞的制備。

        （1） 挑取平板上AH109 酵母細胞的單個克隆至5 mL YPD 培養(yǎng)基中，30℃，搖床振搖培養(yǎng)過夜（可加入2 mg/mL的Adenine 75 μL使酵母生長速度加快）；

        （2） 轉接2.5 mL過夜培養(yǎng)的菌液至50 mL YPD 培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)約3-4 h（OD600~2-4）；

        （3） 用50 mL的離心管收菌，4,500 rpm，3 min ，棄上清；

        （4） 加入20 mL 無菌水洗滌，同樣條件離心，棄上清；

        （5） 用1 mL 無菌水重懸菌液，轉移至1.5 mL的EP 管中；

        （6） 最高速短時離心15 Sec；棄上清；

        （7） 加入450 μL LiAc (0.1 M) 重懸菌體，30℃搖床振搖培養(yǎng)15 min；

        （8） 分裝50 μL/管至EP 管中；

        （9） 最高速短時離心15 Sec；棄上清；

        （10） 每管加入已經配制好的DNA 轉化混合液（可加入40 μL DMSO 以提高轉化效率），徹底重懸細胞，30℃搖床振搖培養(yǎng)45 min；

        （11） 轉移至42℃水浴20 min；

        （12） 冰上放置3 min；

        （13） 最高速短時離心30 Sec；棄上清；

        （14） 加入100 μL 無菌水重懸菌體，涂布于SCM/-2(缺少色氨酸和亮氨酸的酵母合成培養(yǎng)基)氨基酸缺陷型平板上。30℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3 天后觀察菌落生長情況。

         3、酵母雙雜系統(tǒng)相互作用的篩選

        （1） 3 天后，在轉化后的平板上各挑取四個單菌落，分別劃線于SCM/-2、SCM/-3 (缺少色氨酸、亮氨酸和組氨酸的酵母合成培養(yǎng)基) 和SCM/-4 (缺少色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤的酵母合成培養(yǎng)基)氨基酸缺陷型平板上，30℃恒溫箱倒置培養(yǎng)3 天后觀察菌落生長情況。

        （2） 如果菌落能在SCM/-4 平板上正常生長，說明AD-fusion 和BD-fusion兩者之間有強的相互作用；如果不能在SCM-4 平板上正常生長但是能在SCM/-3平板上正常生長，則有弱的相互作用；如果在SCM/-4 和SCM/-3 平板上均不能生長而只能在SCM/-2 平板上生長，則無相互作用。

        好啦，酵母雙雜交的實驗我們就簡單介紹到這里啦，如果您還有其他的問題歡迎隨時留言給客服，技術會及時給到回復，如果您有酵母雙雜實外包或代做的需求，歡迎你選擇——普拉特澤！