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病毒系統(tǒng)的概述：

目前主流的病毒載體系統(tǒng)主要包括慢病毒（LV）、（γ-）逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）、腺病毒（Ad）和腺相關(guān)病毒（AAV）。

慢病毒（LV）和γ- 逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）：均屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。其RNA基因組能逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，穩(wěn)定整合至宿主細(xì)胞基因組中。逆轉(zhuǎn)錄病毒通常分兩種：γ- 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)單一，慢病毒存在一些附屬基因和調(diào)控基因。

腺病毒（ADV）：是一種復(fù)制缺陷型病毒，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，借助特定細(xì)胞系（HEK293）復(fù)制和增殖，不整合到宿主細(xì)胞基因組中。

腺相關(guān)病毒（AAV）：屬微小病毒科，為無(wú)包膜的單鏈線狀 DNA 病毒。只有在腺病毒或者皰疹病毒等輔助病毒協(xié)助下，宿主才能產(chǎn)生具有感染性的AAV，所以 AAV 被稱(chēng)作腺相關(guān)病毒。

下圖是關(guān)于病毒的具體介紹：

下面給大家詳細(xì)介紹一下慢病毒：

慢病毒載體

慢病毒載體（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因（或 RNAi ）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA ，其基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，被自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄為DNA ，再進(jìn)入到細(xì)胞核并整合到細(xì)胞基因組中。整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA ，回到細(xì)胞質(zhì)中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi 干擾。

慢病毒的優(yōu)勢(shì)

1. 慢病毒能夠感染多種難以感染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、非分裂細(xì)胞（神經(jīng)元細(xì)胞）等。

2. 慢病毒能將外源基因整合到細(xì)胞基因組中，穩(wěn)定表達(dá)外源基因。

3. 慢病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株所需時(shí)間較短。

4. 免疫原性低，安全性高。

慢病毒包裝流程

慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)（三質(zhì)粒系統(tǒng)）

1. 慢病毒載體質(zhì)粒（包括GFP、RFP等熒光標(biāo)簽或其他標(biāo)簽，可訂制）

2. 包膜質(zhì)粒

3. 包裝質(zhì)粒

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結(jié)構(gòu)基因*

Gag：編碼p55蛋白前體,經(jīng)蛋白酶裂解而形成病毒的核衣殼蛋白(p7) 、內(nèi)膜蛋白 (p17) 和衣殼蛋白(p24) 。

Pol：編碼病毒復(fù)制所需的酶類(lèi)。

Env：編碼gp120和gp41兩種包膜糖蛋白,決定病毒感染宿主的靶向性。（被VSV-G替代）

輔助基因

Vif：編碼產(chǎn)物與病毒體的感染性有關(guān)。

Vpr：編碼產(chǎn)物的功能尚不清楚。

Nef：編碼負(fù)調(diào)節(jié)蛋白,對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)均有下調(diào)作用。

Vpu：編碼產(chǎn)物與病毒的裝配、成熟和釋放有關(guān)。

調(diào)節(jié)基因*

Tat：編碼gp14，一種反式激活的轉(zhuǎn)錄因子,與LTR (病毒基因組5’和3’端各有的一段長(zhǎng)末端重復(fù)序列)結(jié)合后能促進(jìn)病毒所有基因的轉(zhuǎn)錄。（去掉后會(huì)影響滴度）

Rev：編碼gp19 ，能促進(jìn)未經(jīng)拼接的大mRNA 分子從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)運(yùn),并相對(duì)減少拼接后小mRNA 分子的數(shù)量。

慢病毒產(chǎn)品生產(chǎn)流程

專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)：

Multiplicity of Infection（Mol）, 感染復(fù)數(shù)，指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒顆粒數(shù)，MOI越高，細(xì)胞越難感染。通常把某株細(xì)胞有80%被感染時(shí)的MOI值作為該株細(xì)胞的MOI。

Polybrene：帶正電的小分子，與細(xì)胞表面陰離子結(jié)合能促進(jìn)慢病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，通常能提高2~10倍，但有一定細(xì)胞毒性，濃度需摸索，一般在1~10μg/ml范圍。

常見(jiàn)問(wèn)題回答

1. 在病毒感染時(shí)，不同的細(xì)胞建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置MOI梯度，選擇最適MOI進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

2. 實(shí)際操作中，感染時(shí)是否加polybrene或穩(wěn)株篩選時(shí)是否加嘌呤霉素可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)而定，后續(xù)調(diào)整狀態(tài)可適當(dāng)提高血清濃度。

3. 如何測(cè)滴度？

在載體感染靶細(xì)胞之前，需要滴定產(chǎn)生的載體以調(diào)整載體的劑量。載體效價(jià)對(duì)評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也很關(guān)鍵。

可以使用不同的方法完成滴定：（1）測(cè)量載體制劑中載體顆粒組分的量（物理顆粒數(shù)量/ p24 衣殼濃度/ RT 活性/基因組拷貝數(shù)）; （2）測(cè)量感染細(xì)胞中的原病毒載體 DNA 拷貝數(shù); （3）測(cè)量細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因（通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)或免疫染色）。