RIP檢測實(shí)驗(yàn)操作步驟【RIP檢測外包】
來源/作者:普拉特澤-生物醫(yī)學(xué)整體課題外包平臺
RIP檢測實(shí)驗(yàn)步驟由普拉特澤生物為大家總結(jié)分享。RIP就是RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀,是研究體內(nèi) RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。普拉特澤生物分子檢測平臺為廣大科研人員提供長期穩(wěn)定的RIP檢測外包服務(wù),本文就給大家分享RIP檢測技術(shù)給大家總結(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟:
一、RIP檢測原理與實(shí)驗(yàn)原理
RIP實(shí)驗(yàn)原理:RIP實(shí)驗(yàn)是研究RNA-蛋白之間的相互作用,運(yùn)用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白,通過免疫學(xué)方法將RNA-蛋白復(fù)合物一起分離出來,通過對目的片段的純化與檢測(結(jié)合的RNA序列通過microarCALU-1y(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定),從而分析蛋白質(zhì)和RNA相互作用的信息。
RIP檢測實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備:
1、儀器準(zhǔn)備:臺式冷凍離心機(jī)、渦旋振蕩器、電子天平、PCR儀、移液器、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、水平電泳槽、潔凈工作臺、-80度冰箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋
2、試劑準(zhǔn)備:無水乙醇、苯酚:氯仿:異戊醇、RIP試劑盒、1.5 mL EP管、2 × PCR MIX、IGF2BP2抗體
二、RIP檢測實(shí)驗(yàn)操作步驟
1、設(shè)計引物
2、細(xì)胞裂解
(1)加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞,室溫1000 rpm離心5 min收集細(xì)胞棄上清;重復(fù)一次。
(2)細(xì)胞沉淀中加入0.9 mL polysome lysis buffer,9 μL Protease inhibitor,4.5 μL RNase inhibitor渦旋混勻,冰上放置 10 min。
3、去除 DNA
(1)細(xì)胞裂解液中加4.5 μL DNase salt stock、10 μL DNase (20 U),37℃溫育10 min。
(2)轉(zhuǎn)移樣品到冰浴環(huán)境,快速加入4.5 μL 0.5 M EDTA、1.8 μL 0.5 M EGTA、9 μL DTT,混勻。
(3)4℃,16,000 g 離心10 min轉(zhuǎn)移上清至新的無RNase離心管中。
4、平衡 protein A/G
(1)每組RIP樣品準(zhǔn)備20 μL protein A/G beads,加入0.5 mL polysome lysis buffer,顛倒混勻,磁力架上去上清; 重復(fù)洗一次。
(2)加入20 μL polysome lysis buffer 恢復(fù)初始體積。
5、免疫沉淀
(1)將細(xì)胞裂解樣品按照0.8 mL(IP)、0.1 mL(Input)分成兩份,Input樣品-80℃保存?zhèn)溆谩?/span>
(2)IP 樣品加入實(shí)驗(yàn)抗體或者IgG(陰性對照),垂直混勻器 4℃孵育16 h(過夜)。
(3)IP 樣品加入準(zhǔn)備好的20 μL protein A/G beads,垂直混勻器 4℃孵育1小時,磁力架收集磁珠并去上清。
(4)IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 1、 5 μL DTT洗滌三次去上清, 每次4℃孵育5分鐘。
(5)IP 樣品中加入94.5 μL polysome washing buffer 1、 0.5 μL DNase salt stock、5 μL DNase (5 U),37℃溫育10 min后去上清。
(6)IP 樣品加入0.5 mL polysome washing buffer 2、5 μL DTT洗滌兩次去上清,每次4℃孵育5分鐘。
(7)IP樣品加入100 μL polysome elution buffer、1 μL DTT及2 μL proteinase K重懸珠子,Input樣品加入1 μL DTT及2 μL proteinase K。
(8)55℃孵育1 h,洗脫RNA,磁力架收集磁珠轉(zhuǎn)移上清至新的無RNA酶離心管中。
6、提取 RNA
(1)上清加入等洗脫體積(100 μL)苯酚-氯仿-異戊醇混合液到IP和Input樣品,顛倒混勻15秒。
(2)13000 g,4℃離心10分鐘,收集上層水相,轉(zhuǎn)移到新無RNA離心管中。
(3)加入1 μL Glycogen,10 μL sodium acetate及250 μL 100% ethanol充分顛倒混勻。
(4) –20℃靜置3 h到過夜沉淀RNA樣品。
(5) 4℃,16000 g 離心30分鐘,棄上清。
(6)加入1 mL預(yù)冷的80%乙醇,4℃,16100 g 離心10分鐘,棄上清,室溫風(fēng)干10分鐘。
(7)加入30 μL RNase-free water溶解RNA,-80℃保存。
7、RNA檢測
(1)取2 μL RNA樣品檢測RNA濃度。
7.8 結(jié)合RNA效率驗(yàn)證(PCR)
(1)參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA樣品。
(2)參考PCR試劑盒配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR,取10 μL PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳。
RIP檢測實(shí)驗(yàn)步驟就講完啦,如果您還有什么實(shí)驗(yàn)技術(shù)問題或有RIP檢測外包的需求歡迎隨時聯(lián)系普拉特澤生物~
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