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    Question：同樣是蛋白電泳，SDS-PAGE和PAGE到底有啥不一樣？（普拉特澤生物提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的分子實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)）

   答：SDS-PAGE 毫無疑問是 PAGE 的升級(jí)版，二者都是常用的電泳分離技術(shù)，尤其是 SDS-PAGE更為常用，幾乎是 WB 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)配；而 PAGE（或強(qiáng)調(diào)為NativePAGE）相比之下在蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中較少用到。

在這篇文章中，我們將討論幾個(gè)問題：

• SDS-PAGE與原版PAGE在原理與應(yīng)用范圍上有什么區(qū)別？

• 為什么WesternBlot實(shí)驗(yàn)需要用SDS-PAGE？

• Native PAGE適用于什么情形？

 關(guān)于兩種技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域的區(qū)別

簡(jiǎn)單來說，首先發(fā)明出的PAGE是基礎(chǔ)版，這個(gè)基礎(chǔ)版的原理就是分子篩+電場(chǎng)。作為一個(gè)分離工具，用它跑什么分子都可以。但由于分離蛋白的需求，加上蛋白質(zhì)分子的特性，為了在蛋白實(shí)驗(yàn)中加強(qiáng)蛋白質(zhì)的分離效果，于是就有人想到在樣本與緩沖液中額外加入SDS使蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)分子在電泳過程中僅依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離，這就是SDS-PAGE。

它們的核心區(qū)別毫無疑問在于是否加入SDS（十二烷基硫酸鈉），這是一種離子型去垢劑，通過破壞蛋白質(zhì)中的非共價(jià)鍵使之變性，從三維構(gòu)象變成線性結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程通常被稱為蛋白質(zhì)線性化。另一方面，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后形成復(fù)合物，通過賦予蛋白質(zhì)大量負(fù)電荷來掩蓋蛋白質(zhì)本身表面攜帶的電荷，使其在電泳時(shí)的遷移率僅由分子量大小決定，而不受其原始電荷或形狀的影響。

3 Western Blot為什么需要用SDS-PAGE

WB一般都使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，原因有以下幾點(diǎn)：

1. 抗體識(shí)別線性表位：由于許多抗體只能識(shí)別蛋白質(zhì)的線性表位，需要通過SDS-PAGE將蛋白質(zhì)線性化，使其抗體表位暴露在外，以便抗體結(jié)合。

2. 分子量測(cè)定：變性后的蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率僅與分子量有關(guān)，可以用Marker測(cè)量，從而準(zhǔn)確估計(jì)目標(biāo)蛋白的分子量。

3. 穩(wěn)定性：變性過程破壞了蛋白的活性，避免發(fā)生反應(yīng)，蛋白理論上性質(zhì)更穩(wěn)定一些。

4. 避免蛋白質(zhì)聚集：變性過程破壞非共價(jià)相互作用，避免蛋白質(zhì)聚集或形成復(fù)合物。跑WB為了后期抗體結(jié)合出清晰的條帶，需要讓樣本中的蛋白質(zhì)混合物分離成清晰的一個(gè)一個(gè)的分子；一旦發(fā)生聚集，條帶就不準(zhǔn)確了。

4 Native PAGE適用于做什么

原生版的PAGE是非變性的（NativePAGE），不加入SDS等變性劑，因此它最大的特點(diǎn)就是保留了蛋白質(zhì)的活性。如果說SDS-PAGE是為了通過變性加強(qiáng)蛋白分離效果的魔改版，那么現(xiàn)在也有針對(duì)讓PAGE保留蛋白活性的魔改升級(jí)版，如BN-PAGE。

針對(duì)PAGE非變性這一特點(diǎn)，它更適合應(yīng)用在以下領(lǐng)域：

1. 需保持蛋白質(zhì)活性的情況：由于是非變性條件，蛋白質(zhì)保持其高級(jí)結(jié)構(gòu)，因此其生物活性也得到保留。如果此時(shí)電泳僅作分離，后續(xù)還要繼續(xù)研究如酶活性、配體結(jié)合能力以及其他需要保留原本功能的情況，就需要選擇非變性的PAGE進(jìn)行分離。

2. 分析蛋白質(zhì)聚集體或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用：NativePAGE可以用于分析蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于保留了蛋白間的相互作用，因此某些蛋白質(zhì)也可能會(huì)以多亞基復(fù)合物的形式一起遷移，并以不可預(yù)測(cè)的方式移動(dòng)。這種復(fù)合物常表現(xiàn)為彌散狀條帶，而非通常所見的清晰的條帶。

文源自實(shí)驗(yàn)室老司機(jī)
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